細胞質のCaの測定 2 +絶縁収縮リンパ管における

Summary

我々は、細胞質のCaを評価するアプローチを紹介<sup> 2 +</supCaを研究するために分離されたリンパ管の>濃度^{2 +}依存し、Ca<sup> 2 +</supリンパ管平滑筋収縮の>増感メカニズム。

Abstract

リンパ管は、流体の恒常性を維持する中心的な循環する脂質を提供し、潜在的に有害な抗原のための監視システムとして機能する、粘膜免疫と適応免疫応答^1を最適化する多機能搬送システムを含む。リンパは、ブラインドエンドの初期リンパ管に入り、その後大規模な収集リンパ管に圧力勾配に逆らって輸送される間質液から形成される。各収集リンパ管は、逆流を防ぐ二尖弁で区切られたlymphangionsと呼ばれる一連のセグメントから構成されている。 Each lymphangionは、中心循環^2の方向の圧力勾配に逆らってリンパ液を推進収縮サイクルを持っています。この相動性収縮パターンは、収縮期および拡張期の段階で、心周期に類似しており、低収縮の頻度^4。さらに、リンパ管平滑筋のトーンを生成し、筋原性収縮と膨張を表示されるiそれぞれ管腔の圧力の増減について^、5〜n個の応答。リンパ管の相動性および持続性収縮性の両方をサポートしている分子メカニズムのハイブリッドは、このように提案されている。

平滑筋の収縮は、一般的に細胞質ゾルのCa ²によって規制されています⁺濃度（[Ca ^{2 _+]} iの）のCa ^2〜プラス感受性^+、セル^6を取り巻く環境の変化に応答して、収縮要素の。 〔Ca ^{2 +]} _iは原形質膜のリガンドまたは電位依存性Ca ^{2 +}チャネルと内部貯蔵からのCa ^{2 +}の放出と取り込みを介してのCa ^{2 +}の動きの組み合わせによって決定されます。細胞質ゾルのCa ^{2 +}カルモジュリンに結合し、そのようなミオシン軽鎖の酵素を活性化（MLC）順番にMLCはアクチン-ミオシンを介する収縮⁸につながるリン酸化するキナーゼ（MLCK）、。ただし、CAへのこの経路の感度<sup> 2 +は、MLCホスファターゼ^（MLCP）9により調整することができます。 MLCP活性は、Rhoキナーゼ（ROCK）とミオシンホスファターゼ阻害タンパク質CPI – 17によって制御されている。

ここで、我々は、Ca ^{2 +}依存性とCaのリンパ管平滑筋収縮の^{2 +}増感メカニズムを研究するために、孤立した、潅流リンパ管に時間をかけて[Ca ^{2 _+]} iの変化を評価する方法を提示する。リンパ管を収集する単離されたラットの腸間膜を用いて、我々は〔Ca ^{2 +]} _iと収縮活性の延伸による変化を調べた。孤立リンパモデルは、圧力、流量、および浴溶液の化学組成が厳密に制御できるという利点を提供しています。の[Ca ^{2 +]} _iはレシオメトリックは、Ca ^{2 +}結合色素フラ-2でリンパ管をロードすることによって決定された。これらの研究は、一過性調節する別の分子メカニズムを研究の広範な問題に新しいアプローチを提供しますリンパ管平滑筋の強直収縮に対する収縮。

Protocol

1。動物すべての手順は、ルイジアナ州立大学健康科学センターでの動物実験使用の委員会によって承認されたと米国立衛生研究所（NIH出版番号85から12まで、1996年改訂）のガイドラインに従って行った。雄のSprague – Dawleyラット（チャールズリバー研究所、270〜350グラム本体重量）が制御された温度（22℃）と制御の照明（12:12 hの光暗サイクル）の環境で飼育し​​た。到着後、ラッ?…

Discussion

手法の新たな組み合わせはリンパ管のポンプ組み込み関数を勉強するために採用した。同時にリンパ管をポンプでの[Ca ^{2 +]} _iと直径の変化を測定する能力は、リンパ管収縮サイクルを支配する全体的な機構におけるCa ^{2 +}依存性とCa ^{2 +}感受性を高めるシグナル伝達経路の相対的寄与の研究のためにできるようになります。

リンパ管収縮サイ?…

Materials

<tdChemical

1. Ringer 5x Stock
Company	Catalog Number	Amount
Sodium Chloride	EMD	SX0420-3	35 g
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040	1.75 g
Calcium Chloride	Sigma	C-3881	1.47 g
Magnesium Sulfate	Sigma	M-9397	1.44 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
2. MOPS buffer
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
MOPS	Sigma	M3183	125.6 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
3. Albumin Physiological Salt Solution (APSS)
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
Ringer stock (5x)	N/A	N/A	200 mL
Mops Buffer	N/A	N/A	5 mL
Sodium Phosphate	Sigma	S-9638	0.168 g
Sodium Pyruvate	Sigma	P5280	0.22 g
EDTA sodium salt	Sigma	ED2SS	0.0074 g
Glucose	Sigma	G7528	0.901 g
Albumin, Bovine	USB	10856	10 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Adjust pH to 7.4 at 37° C, then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C.

Table 1. Specific Reagents Used. Store all at 4 °C.