Cytosolic CA의 측정 2 + 절연 수축성 Lymphatics에

Summary

우리는 cytosolic CA를 평가하는 접근 방법을 소개합니다<sup> 2 +</supCA를 공부 격리 lymphatics에> 집중^{2 +} 종속 및 CA<sup> 2 +</sup림프 평활근의 수축> – sensitizing 메커니즘.

Abstract

림프 혈관은 액체 항상성 유지 중앙 순환에 lipids를 제공하고, 잠재적으로 해로운 항원에 대한 감시 시스템 역할, 점막 면역과 적응 면역 반응 ¹ 최적화 다기능 교통 시스템을 구성. 림프는 맹인 종단 초기 lymphatics를 입력하고, 다음 큰 수집 lymphatics에서 압력 구배에 대한 수송이다 중간 유체로부터 형성됩니다. 각 수집 림프는 역류를 방지 뾰족한 끝이 둘있는 밸브로 구분 lymphangions라는 세그먼트의 일련의 구성됩니다. 각 lymphangion는 중앙 혈액 ^순환이 방향 압력 구배에 대한 림프을 향한 추진력을 얻습니다 수축성 사이클을 가지고 있습니다. 이 phasic 수축성 패턴은 수축기 및 diastolic 단계와 심장주기에 유사하고, 낮은 수축 주파수 ^4. 또한, 림프 평활근은 음색을 생성하고 myogenic 수축과 팽창을 표시 I각각 luminal 압력 증가와 감소, ⁵ N 응답. lymphatics의 phasic와 토닉 수축성을 모두 지원하는 분자 메커니즘의 하이브리드 따라서 제안하고 있습니다.

평활근의 수축은 일반적으로 cytosolic 칼슘 ^{2 +} 농도 규제 ([칼슘 ^{2 +]} _I) 칼슘 ² 플러스 감성 ^+, 세포 ⁶ 주변 환경의 변화에 대한 응답으로 수축성 요소. [칼슘 ^{2 +]} _제가 ⁺ 플라즈마 막 리간드 또는 전압 문이 칼슘 ^{2 +} 채널과 ⁺ 내부 상점에서 칼슘 ^2의 릴리스와 이해를 통해 칼슘 ^2의 운동의 조합에 의해 결정됩니다. Cytosolic 칼슘 ^{2 +} calmodulin에 바인딩 및 마이 오신 조명 체인으로 효소를 활성화 (MLC) 차례로 MLC는 굴지 – 마이 오신 – 중재 수축 ⁸ 선도 phosphorylates 키나제 (MLCK). 그러나, 칼슘이 경로의 감도 <sup> 2 +는 MLC 인산 가수 분해 효소 (MLCP) ⁹ 조정할 수 있습니다. MLCP 활동 Rho 키나제 (바위)과 마이 오신의 인산 가수 분해 효소 억제제 단백질 CPI – 17에 의해 규제됩니다.

여기, 우리는 칼슘 ^{2 +} – 의존과 ^칼슘이 림프 평활근의 수축의 ⁺ – sensitizing 메커니즘을 연구하기 위해 절연, perfused lymphatics에서 시간이 지남에 따라 ^[+ 칼슘 ^2] _나는 변화를 평가하는 방법을 제시한다. 절연 쥐 mesenteric 수집 lymphatics를 사용하여 우리는 ^[+ 칼슘 ^2] _I 및 수축성 활동에 스트레칭 유발 변화를 공부했습니다. 격리된 림프 모델은 압력, 유량 및 욕조 솔루션의 화학 성분이 밀접하게 제어할 수있는 장점을 제공합니다. [칼슘 ^{2 +]} _제가 ratiometric, CA ^{2 +} 바인딩 염색 Fura – 2 lymphatics 로딩에 의해 결정되었다. 이러한 연구는 phasic 조절 다른 분자 메커니즘을 연구의 광범위한 문제에 대한 새로운 접근 방법을 제공합니다림프 평활근의 수축 토닉 대 수축.

Protocol

1. 동물 모든 절차는 루이지애나 주립 대학 보건 과학 센터에서 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었으며 건강의 국립 연구소 (NIH 간행물 번호 85-12, 1996 개정)의 지침에 따라 수행되었다. 남자 스프 – Dawley 쥐 (찰스 리버 연구소, 2백70-3백50g 몸 wt)는 제어 온도 (22 ° C) 및 제어 조명 (12시 12분 H 조명 어두운 사이클) 환경에 보관되어 있었다. 도착 후, 쥐가는 한 주간의 acclimation 기간?…

Discussion

방법의 소설 조합은 림프 혈관의 펌핑 본질을 연구하기 위해 고용되었다. 동시에 변화 측정 기능 [칼슘 ^{2 +]} _i와 펌핑 lymphatics의 직경은 칼슘 ^2의 상대적인 기여도 ⁺ 종속 및 CA ² 림프 수축성주기를 지배하는 전체 메커니즘에 ⁺ – sensitizing 신호 경로. 연구를 허용합니다

림프 수축성주기 톤 이상 겹쳐 phasic 수축으로 구성되어 있습…

Materials

<tdChemical

1. Ringer 5x Stock
Company	Catalog Number	Amount
Sodium Chloride	EMD	SX0420-3	35 g
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040	1.75 g
Calcium Chloride	Sigma	C-3881	1.47 g
Magnesium Sulfate	Sigma	M-9397	1.44 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
2. MOPS buffer
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
MOPS	Sigma	M3183	125.6 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
3. Albumin Physiological Salt Solution (APSS)
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
Ringer stock (5x)	N/A	N/A	200 mL
Mops Buffer	N/A	N/A	5 mL
Sodium Phosphate	Sigma	S-9638	0.168 g
Sodium Pyruvate	Sigma	P5280	0.22 g
EDTA sodium salt	Sigma	ED2SS	0.0074 g
Glucose	Sigma	G7528	0.901 g
Albumin, Bovine	USB	10856	10 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Adjust pH to 7.4 at 37° C, then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C.

Table 1. Specific Reagents Used. Store all at 4 °C.