Måling av cytosoliske Ca 2 + I isolerte kontraktile lymfesystem

Summary

Vi introduserer en tilnærming for å evaluere cytosoliske Ca^{2 +} Konsentrasjon i isolerte lymfekar å studere Ca^{2 +}-Avhengige og Ca^{2 +}-Sensibiliserende mekanismer av lymfatisk glatt muskel sammentrekning.

Abstract

Lymfekar utgjør et multifunksjonelt transport system som opprettholder væske homeostase, leverer lipider til den sentrale sirkulasjon, og fungerer som et overvåkingssystem for potensielt skadelige antigener, optimalisere mucosal immunitet og adaptive immunresponser ^1. Lymfe er dannet fra interstitiell væske som kommer blind-ended innledende lymfekjertlene, og deretter transporteres mot en trykkgradient i større samle lymfekar. Hver samle lymfatisk består av en rekke segmenter som kalles lymphangions, atskilt av bicuspid ventiler som hindrer tilbakestrømning. Hver lymphangion besitter en kontraktile syklus som driver lymph mot en trykkgradient mot den sentrale sirkulasjon ^2. Dette phasic kontraktile mønsteret er analogt til hjerte-syklus, med systolisk og diastolisk faser, og med en lavere sammentrekning frekvens ^fire. I tillegg genererer lymphatic glatt muskel tone og viser myogenic innsnevring og utvidelse in respons på økning og reduksjon i luminal press, henholdsvis ^5. En hybrid av molekylære mekanismer som støtter både phasic og tonic kontraktilitet av lymfekjertlene er dermed foreslått.

Sammentrekning av glatt muskulatur er generelt regulert av cytosoliske Ca ^{2 +} konsentrasjon ([Ca ^{2 +]} _i) pluss sensitivitet til Ca ^{2 +,} av kontraktile elementer i respons til endringer i miljøet som omgir cellen ^6. [Ca ^{2 +]} _i er bestemt av kombinasjonen av bevegelsen av Ca ^{2 +} gjennom plasmamembranen ligand eller spenning gated Ca ^{2 +} kanaler og frigjøring og opptak av Ca ^{2 +} fra interne butikker. Cytosoliske Ca ^{2 +} binder seg til calmodulin og aktiverer enzymer som myosin lett kjede (MLC) kinase (MLCK), som igjen phosphorylates MLC fører til actin-myosin-mediert kontraksjon ^8. Men følsomheten av denne veien til Ca <sup> 2 + kan reguleres av MLC fosfatase (MLCP) ^9. MLCP aktiviteten er regulert av Rho kinase (ROCK) og myosin fosfatase inhibitor protein KPI-17.

Her presenterer vi en metode for å vurdere endringer i [Ca ^{2 +]} _i over tid i isolerte, perfused lymfekjertlene for å studere Ca ^{2 +-avhengige} og Ca ^{2 +-sensibiliserende} mekanismer av lymfatisk glatt muskel sammentrekning. Bruk isolerte rotte mesenteric samle lymfekar vi studert stretch-indusert forandringer i [Ca ^{2 +]} _i og kontraktil aktivitet. Den isolerte lymfatiske Modellen har den fordelen at trykk, flow, og den kjemiske sammensetningen av badekaret løsningen kan være strengt kontrollert. [Ca ^{2 +]} _i ble bestemt ved lasting lymfekar med ratiometric, ² Ca ^+-bindende dye Fura-2. Disse studiene vil gi en ny tilnærming til bredere problemet med å studere de forskjellige molekylære mekanismer som regulerer phasicsammentrekninger versus tonic innsnevring i lymfatisk glatt muskulatur.

Protocol

1. Dyr Alle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og Bruk komité ved Louisiana State University Health Sciences Center og ble utført i samsvar med retningslinjene for National Institute of Health (NIH publikasjon nr 85-12, revidert 1996). Mann Sprague-Dawley rotter (Charles River Laboratories, 270-350 g kropp vekt) ble plassert i en kontrollert temperatur (22 ° C) og kontrollert belysning (12:12 h lyse mørke syklus) miljø. Etter ankomst ble rottene sendt til en ukes akklimatiseringsperiode…

Discussion

En roman kombinasjon av metoder ble benyttet for å studere iboende pumping av lymfekar. Muligheten til å samtidig måle forandringer i [Ca ^{2 +]} _i og diameter i pumping lymfekar vil tillate for studier av relative bidrag av Ca ^{2 +-avhengige} og Ca ^{2 +-sensibiliserende} signalveier i den generelle mekanismen som styrer lymfatiske kontraktile syklus.

Det lymfatiske kontraktile syklus består av phasic sammentrekninger oppå tone. Dataene viser at hver…

Materials

<tdChemical

1. Ringer 5x Stock
Company	Catalog Number	Amount
Sodium Chloride	EMD	SX0420-3	35 g
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040	1.75 g
Calcium Chloride	Sigma	C-3881	1.47 g
Magnesium Sulfate	Sigma	M-9397	1.44 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
2. MOPS buffer
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
MOPS	Sigma	M3183	125.6 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
3. Albumin Physiological Salt Solution (APSS)
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
Ringer stock (5x)	N/A	N/A	200 mL
Mops Buffer	N/A	N/A	5 mL
Sodium Phosphate	Sigma	S-9638	0.168 g
Sodium Pyruvate	Sigma	P5280	0.22 g
EDTA sodium salt	Sigma	ED2SS	0.0074 g
Glucose	Sigma	G7528	0.901 g
Albumin, Bovine	USB	10856	10 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Adjust pH to 7.4 at 37° C, then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C.

Table 1. Specific Reagents Used. Store all at 4 °C.