Medição do Ca citosólico 2 + Em Isolated linfáticos contráteis

Summary

Nós introduzimos uma abordagem para avaliar o Ca citosólico^{2 +} Concentração no sistema linfático isolado para estudar Ca^{2 +}-Dependente e Ca^{2 +} Sensibilizante mecanismos de contração do músculo liso linfático.

Abstract

Vasos linfáticos formam um sistema de transporte multifuncional que mantém a homeostase dos fluidos, oferece lípidos para a circulação central, e atua como um sistema de vigilância para os antígenos potencialmente prejudiciais, otimizando a imunidade da mucosa e respostas imunes adaptativas ^1. A linfa é formado a partir de líquido intersticial que entra cego-ended linfáticos iniciais, e depois é transportado contra um gradiente de pressão na maior sistema linfático coleta. Cada linfáticos é composta de uma série de segmentos chamados lymphangions, separados por válvulas bicúspide, que impedem o refluxo. Cada lymphangion possui um ciclo de contração que impulsiona linfáticos contra um gradiente de pressão para a circulação central ^2. Este padrão contrátil fásica é análogo ao do ciclo cardíaco, com fases sistólica e diastólica, e com menor freqüência ⁴ contração. Além disso, o músculo liso linfático gera tom e exibe miogênica constrição e dilatação in resposta a aumentos e diminuições na pressão luminal, respectivamente ^5. Um híbrido de mecanismos moleculares que suportam tanto a contratilidade fásicas e tônicas dos vasos linfáticos são assim propostas.

Contração do músculo liso é geralmente regulado pelo Ca ^{2 +} citosólico concentração ([Ca ^{2 +]} _i) a sensibilidade de mais para Ca ^{2 +,} dos elementos contrátil em resposta a mudanças no ambiente ao redor da célula ^6. [Ca ^{2 +]} _i é determinado pela combinação do movimento do Ca ^{2 +} através da membrana plasmática ligante ou tensão gated Ca ^{2 +} e canais a liberação e absorção de Ca ^{2 +} das lojas internas. Citosólica de Ca ^{2 +} se liga a calmodulina e ativa enzimas como a cadeia leve de miosina (MLC) quinase (MLCK), que por sua vez fosforila MLC levando a actina-miosina-contração mediada ^8. No entanto, a sensibilidade desta via de Ca <sup> 2 + pode ser regulada pela fosfatase MLC (MLCP) ^9. MLCP atividade é regulada por Rho quinase (Rock) e da proteína miosina inibidor da fosfatase CPI-17.

Aqui, apresentamos um método para avaliar as alterações na [Ca ^{2 +]} _i ao longo do tempo isolado, vasos linfáticos perfundidos para estudar Ca ^{2 +-dependente} e Ca ^{2 +-sensibilizar} os mecanismos de contração do músculo liso linfático. Usando linfáticos mesentéricos isolados de ratos coletando estudamos estiramento induzido por mudanças na [Ca ^{2 +]} _i e atividade contrátil. O modelo linfático isolado oferece a vantagem de pressão, fluxo e da composição química da solução de banho podem ser bem controladas. [Ca ^{2 +]} _i foi determinado pela carga linfáticos com o raciométrica, Ca ^{2 +-binding} corante Fura-2. Estes estudos fornecem uma nova abordagem ao problema mais amplo de estudar os diferentes mecanismos moleculares que regulam fásicacontrações contra constrição tônica no músculo liso linfático.

Protocol

1. Animais Todos os procedimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use na Louisiana State University Health Sciences Center e foram realizados de acordo com as diretrizes do Instituto Nacional de Saúde (NIH publicação 85-12 No., revista em 1996). Masculino Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, 270-350 g de corpo wt) foram alojados em uma temperatura controlada (22 ° C) e iluminação controlada (12:12 h ciclo de luz escuro) ambiente. Após a chegada, os ratos foram submeti…

Discussion

A nova combinação de métodos foi empregado para estudar intrínseca de bombeamento dos vasos linfáticos. A capacidade de medir simultaneamente mudanças na [Ca ^{2 +]} _i e diâmetro no sistema linfático de bombeamento permitirá estudos sobre as contribuições relativas de Ca ^{2 +-dependente} e Ca ^{2 +-sensibilizantes} vias de sinalização em todo o mecanismo que rege o ciclo linfática contrátil.

O ciclo contrátil linfática consiste em contraç…

Materials

<tdChemical

1. Ringer 5x Stock
Company	Catalog Number	Amount
Sodium Chloride	EMD	SX0420-3	35 g
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040	1.75 g
Calcium Chloride	Sigma	C-3881	1.47 g
Magnesium Sulfate	Sigma	M-9397	1.44 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
2. MOPS buffer
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
MOPS	Sigma	M3183	125.6 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
3. Albumin Physiological Salt Solution (APSS)
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
Ringer stock (5x)	N/A	N/A	200 mL
Mops Buffer	N/A	N/A	5 mL
Sodium Phosphate	Sigma	S-9638	0.168 g
Sodium Pyruvate	Sigma	P5280	0.22 g
EDTA sodium salt	Sigma	ED2SS	0.0074 g
Glucose	Sigma	G7528	0.901 g
Albumin, Bovine	USB	10856	10 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Adjust pH to 7.4 at 37° C, then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C.

Table 1. Specific Reagents Used. Store all at 4 °C.