Medición de la citosólica de Ca 2 + En aislados linfáticos contráctil

Summary

Se introduce un enfoque para evaluar la citosólica de Ca^{2 +} Concentración en los vasos linfáticos aislados para estudiar Ca^{2 +}-Dependiente y Ca^{2 +} Sensibilizante mecanismos de contracción del músculo liso linfático.

Abstract

Los vasos linfáticos forman un sistema de transporte multifuncional que mantiene la homeostasis de fluidos, proporciona los lípidos de la circulación central, y actúa como un sistema de vigilancia para los antígenos potencialmente peligrosos, la optimización de inmunidad de la mucosa y la respuesta inmune adaptativa ^1. Linfático está formado por el líquido intersticial que entra ciegos composición linfáticos iniciales, y luego se transporta en contra de un gradiente de presión en los vasos linfáticos más grandes de recolección. Cada linfático recolección se compone de una serie de segmentos llamados linfangiones, separados por válvulas bicúspides que evitar el reflujo. Cada lymphangion posee un ciclo de contracción que impulsa la linfa en contra de un gradiente de presión hacia la circulación central ^2. Este patrón de contracción fásica es análoga a la del ciclo cardíaco, con fases sistólica y diastólica, y con una contracción del ⁴ de baja frecuencia. Además, el músculo liso linfático genera tono y muestra la constricción y la dilatación miogénica in respuesta a los aumentos y disminuciones en la presión luminal, respectivamente ^5. Un híbrido de los mecanismos moleculares que apoyan tanto la contractilidad fásica y tónica de los linfáticos Así, se proponen.

Contracción del músculo liso está regulada por la citosólica de Ca ^{2 +} de concentración ([Ca ^{2 +]} _i), además de la sensibilidad a Ca ^{2 +,} de los elementos contráctiles en respuesta a cambios en el entorno que rodea la célula ^6. [Ca ^{2 +]} _i se determina por la combinación del movimiento de la Ca ^{2 +} a través de la membrana plasmática del ligando o voltaje de ^{Ca2 +} y los canales de la liberación y absorción de Ca ^{2 +} en las tiendas internas. Citosólica de Ca ^{2 +} se une a la calmodulina y activa las enzimas tales como la cadena ligera de la miosina (MLC) quinasa (MLCK), que a su vez fosforila MLC que conduce a la actina-miosina mediada por la contracción ^8. Sin embargo, la sensibilidad de esta vía a Ca <sup> 2 + puede ser regulada por la fosfatasa MLC (PCML) ^9. PCML actividad está regulada por la Rho quinasa (ROCK) y la fosfatasa miosina inhibidor de la proteína CPI-17.

A continuación, presentamos un método para evaluar los cambios en la [Ca ^{2 +]} _i en el tiempo en los vasos linfáticos aislados, perfundidos con el fin de estudiar Ca ^{2 +-dependiente} y Ca ^{2 +-sensibilizar} a los mecanismos de contracción del músculo liso linfático. El uso aislado linfáticos mesentéricos de ratas se estudió la recogida estirar los cambios inducidos en el [Ca ^{2 +]} _i y la actividad contráctil. El modelo linfático aislado ofrece la ventaja de que la presión, el flujo y la composición química de la solución del baño puede ser muy controlado. [Ca ^{2 +]} _i fue determinada por la carga de vasos linfáticos con el radiométrica, Ca ^{2 +-unión} del colorante Fura-2. Estos estudios proporcionan un nuevo enfoque al problema más amplio de estudio de los diferentes mecanismos moleculares que regulan fásicacontracciones tónico contra la constricción del músculo liso linfático.

Protocol

1. Los animales Todos los procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en la Louisiana State University Health Sciences Center, y se realizaron de acuerdo con las directrices del Instituto Nacional de Salud (NIH publicación N º 85-12, revisada en 1996). Las ratas macho Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, 270-350 g de peso corporal) fueron alojados en una temperatura controlada (22 ° C) y la iluminación controlada (12:12 h ciclo de luz oscuridad) medio ambien…

Discussion

Una nueva combinación de métodos se emplean para el estudio intrínseco de bombeo de los vasos linfáticos. La capacidad de medir simultáneamente los cambios en la [Ca ^{2 +]} _i y el diámetro de los vasos linfáticos de bombeo permitirá que para el estudio de las contribuciones relativas de Ca ^{2 +-dependiente} y Ca ^{2 +-sensibilizar} a las vías de señalización en el mecanismo general que rigen el ciclo de contracción linfático.

El ciclo de cont…

Materials

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1. Ringer 5x Stock
Company	Catalog Number	Amount
Sodium Chloride	EMD	SX0420-3	35 g
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040	1.75 g
Calcium Chloride	Sigma	C-3881	1.47 g
Magnesium Sulfate	Sigma	M-9397	1.44 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
2. MOPS buffer
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
MOPS	Sigma	M3183	125.6 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
3. Albumin Physiological Salt Solution (APSS)
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
Ringer stock (5x)	N/A	N/A	200 mL
Mops Buffer	N/A	N/A	5 mL
Sodium Phosphate	Sigma	S-9638	0.168 g
Sodium Pyruvate	Sigma	P5280	0.22 g
EDTA sodium salt	Sigma	ED2SS	0.0074 g
Glucose	Sigma	G7528	0.901 g
Albumin, Bovine	USB	10856	10 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Adjust pH to 7.4 at 37° C, then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C.

Table 1. Specific Reagents Used. Store all at 4 °C.