Mätning av cytosoliska Ca 2 + I enstaka kontraktila lymphatics

Summary

Vi presenterar en metod för att utvärdera cytosoliska Ca^{2 +} Koncentration i enstaka lymfkärlen att studera Ca^{2 +}-Beroende och Ca^{2 +}-Allergiframkallande mekanismer lymfatisk glatt muskulatur kontraktion.

Abstract

Lymfkärl består av ett multifunktionellt transportsystem som håller vätska homeostas, levererar lipider till den centrala cirkulationen, och fungerar som ett övervakningssystem för potentiellt skadliga antigener, optimera slemhinnor immunitet och adaptiva immunsvaret ^1. Lymfan bildas från interstitiell vätska som kommer in döda slutade initiala lymfkärlen, och sedan transporteras mot en tryckgradient i större samla lymfkärlen. Varje samla lymfatiska består av en serie segment som kallas lymphangions, separerade med bicuspid ventiler som hindrar återflöde. Varje lymphangion besitter en kontraktila cykel som driver lymfan mot en tryckgradient mot de centrala cirkulationen ^2. Detta phasic kontraktila mönster är analogt med hjärt-cykel med systoliskt och diastoliskt faser, och med en lägre kontraktion frekvens ^4. Dessutom genererar lymfatisk tonus i glatt och visar myogenic sammandragning och utvidgning in svar på ökningar och minskningar i luminala tryck, respektive ^5. En hybrid av molekylära mekanismer som stödjer både phasic och tonic kontraktilitet av lymfkärlen är därmed föreslås.

Sammandragning av glatt muskulatur i allmänhet regleras av cytosoliskt Ca ^{2 +} koncentration ([Ca ^{2 +]} _i) plus känslighet för Ca ^{2 +,} av kontraktila element som svar på förändringar i miljön som omger cellen ^6. [Ca ^{2 +]} _i är bestäms av kombinationen av rörelse Ca ^{2 +} genom plasmamembranet ligand eller spänningsstyrda Ca ^{2 +-kanaler} och utsläpp och upptag av Ca ^{2 +} från interna butiker. Cytosoliskt Ca ^{2 +} binder till calmodulin och aktiverar enzymer som myosin lätt kedja (MLC) kinas (MLCK), som i sin tur fosforylerar MLC leder till aktin-myosin-medierad kontraktion ^8. Men känsligheten för denna väg till Ca <sup> 2 + kan regleras av MLC-fosfatas (MLCP) ^9. MLCP verksamhet är reglerad av Rho-kinas (ROCK) och myosin fosfatas hämmare protein KPI-17.

Här presenterar vi en metod för att utvärdera förändringar i ^{[Ca2 +]} _i tiden i isolerade, perfusion lymphatics för att studera ^{Ca2 +-beroende} och Ca ^{2 +-allergiframkallande} mekanismer lymfatisk glatt muskulatur kontraktion. Använda isolerade råtta mesenteriska samla lymfkärlen vi studerade sträck-inducerade förändringar i ^{[Ca2 +]} _i och kontraktila aktiviteten. De isolerade lymfatiska modellen har den fördelen att tryck, flöde och den kemiska sammansättningen av badet lösningen hårt kan kontrolleras. [Ca ^{2 +]} _Jag var fast besluten genom att ladda lymfkärlen med ratiometrisk, ^{Ca2 +-bindande} dye Fura-2. Dessa studier kommer att ge en ny syn på det bredare problemet med att studera olika molekylära mekanismer som reglerar phasicsammandragningar kontra tonic sammandragning i lymfatisk glatt muskulatur.

Protocol

1. Djur Alla förfaranden har godkänts av Institutional Animal Care och använda kommittén vid Louisiana State University Health Sciences Center och utfördes i enlighet med riktlinjerna för National Institute of Health (NIH publikation nr 85-12, reviderad 1996). Man Sprague-Dawley råttor (Charles River Laboratories, 270-350 g kroppen wt) var inrymt i en kontrollerad temperatur (22 ° C) och kontrollerad belysning (00:12 h ljus mörker-cykel) miljö. Efter ankomsten var råttorna in till en veckas acklima…

Discussion

En ny kombination av metoder som var anställd för att studera inneboende pumpning av lymfkärl. Förmågan att samtidigt mäta förändringar i ^{[Ca2 +]} _i och diameter i pumpning lymfkärlen kommer att möjliggöra studier av relativa bidrag ^{Ca2 +-beroende} och Ca ^{2 +-allergiframkallande} signalvägar i den övergripande mekanism som styr det lymfatiska kontraktila cykeln.

Den lymfatiska kontraktila cykeln består av phasic sammandragningar ovanpå …

Materials

<tdChemical

1. Ringer 5x Stock
Company	Catalog Number	Amount
Sodium Chloride	EMD	SX0420-3	35 g
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040	1.75 g
Calcium Chloride	Sigma	C-3881	1.47 g
Magnesium Sulfate	Sigma	M-9397	1.44 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
2. MOPS buffer
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
MOPS	Sigma	M3183	125.6 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
3. Albumin Physiological Salt Solution (APSS)
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
Ringer stock (5x)	N/A	N/A	200 mL
Mops Buffer	N/A	N/A	5 mL
Sodium Phosphate	Sigma	S-9638	0.168 g
Sodium Pyruvate	Sigma	P5280	0.22 g
EDTA sodium salt	Sigma	ED2SS	0.0074 g
Glucose	Sigma	G7528	0.901 g
Albumin, Bovine	USB	10856	10 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Adjust pH to 7.4 at 37° C, then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C.

Table 1. Specific Reagents Used. Store all at 4 °C.