Dépistage ARNi pour identifier les phénotypes postembryonnaires dans C. elegans</em
Summary
Nous décrivons une méthode pour identifier des régulateurs sensibilisés postembryonnaires de l'expression des protéines et la localisation dans<em> C. elegans</em> L'aide d'un écran de génomique ARNi-sol et un transgène intégré qui exprime une fonctionnelle, la protéine fluorescente étiqueté.
Abstract
C. elegans s'est avéré être un système de modèle précieux pour la découverte et la caractérisation fonctionnelle des gènes de nombreuses voies et 1 gène. Des outils plus sophistiqués et les ressources pour les études dans ce système sont faciliter la découverte continue de gènes présentant des phénotypes plus subtils ou des rôles.
Ici, nous présentons un protocole généralisé, nous avons adapté pour identifier C. gènes elegans avec des phénotypes postembryonnaires d'intérêt en utilisant le phénomène 2. Cette procédure peut être facilement modifié pour doser le phénotype de choix, que ce soit par l'optique de lumière ou de la fluorescence sur un microscope à dissection ou composé. Ce protocole de dépistage capitalise sur les actifs physiques de l'organisme et des outils moléculaires de la C. elegans communauté de la recherche a produit. A titre d'exemple, nous démontrons l'utilisation d'un transgène intégré qui exprime un produit fluorescent dans un écran ARNi pour identifier les gènes nécessaires à la localisation normale de cetteproduit chez les larves et les adultes stade tardif. Tout d'abord, nous avons utilisé un génomique disponible dans le commerce bibliothèque ARNi avec pleine longueur inserts d'ADNc. Cette bibliothèque facilite l'identification rapide de plusieurs candidats par réduction ARNi du produit du gène candidat. Deuxièmement, nous avons généré un transgène intégré qui exprime notre protéine fluorecently marqué de l'intérêt dans un contexte sensible ARNi. Troisièmement, à exposer les animaux éclos à l'ARNi, cet écran permet l'identification de produits géniques qui ont un rôle vital embryonnaires qui seraient autrement masquer un rôle post-embryonnaire dans la régulation de la protéine d'intérêt. Enfin, cet écran utilise un microscope composé doté pour la résolution de cellule unique.
Protocol
Discussion
La méthode de dépistage RNAi présentée ici permet une analyse rapide et sensible des produits des gènes nécessaires à la normale (ou transgéniques) phénotype postembryonnaire. L'exemple montré est un écran de gènes impliqués dans la localisation subcellulaire d'une protéine fluorescente étiqueté. Toutefois, ce protocole peut être modifié pour identifier les gènes qui affectent d'autres phénotypes postembryonnaires d'intérêt.
Cette méthode tire parti d&#…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Rick Padgett (Waksman Institute, l'Université Rutgers, New Jersey) pour le don de la DBL-1 d'ADNc et le Dr Christopher Rongo (Waksman Institute, l'Université Rutgers, New Jersey) pour un marqueur d'injection. Le laboratoire du Dr Barth Grant effectué le bombardement canon à gènes pour l'intégration du nombre de copies bas de la GFP-tagged DBL-1 construit. Le laboratoire de René Garcia fourni une assistance technique lors de la création de texIs100. Le Garcia René, Lints Robyn, et Hongmin Qin laboratoires ont fourni des conseils productifs. Ce travail a été financé par fonds de démarrage du ministère TAMHSC de médecine moléculaire et cellulaire. Le champ d'application composé et confocale disque de rotation ont été achetés avec des fonds fournis par le département et le Collège TAMHSC du Bureau médecine du doyen.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| NGM Agar | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc | Can be prepared following NGM agar protocol25 |
| M9 Medium | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4 |
26 | |
| Agar-Agar | EMD Chemicals Inc. | 1.01614.1000 | 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter). |
| Bacto Peptone | Becton Dickinson – Difco CP | 211677 | 0.25% |
| IPTG | Research Products International Corp. | I56000-5.0 | 1 mM final concentration |
| carbenicillin | Research Products International Corp. | C46000-5.0 | 50 μg/ml working dilution |
| LB Broth Lennox | Becton Dickinson – Difco CP | 240230 | 20 g/liter |
| tetracycline | Sigma | 268054 | 12.5 μg/ml working dilution |
| sodium hypochlorite | Any brand | 5% household bleach | Use fresh bleach. |
| sodium hydroxide | Any Brand | CAS 1310-73-2 | 5 N stock |
| M9 medium | Wormlab Recipe Book | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab | 26 |
| levamisol | Sigma | 31742 | 100 μM – 1 mM working dilution |
| sodium azide | Fisher Scientific | S227 | 10 mM in M9 working dilution |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | VWR distributor |
| microscope slides | Any brand | 75 x 25 x 1 mm | |
| microscope cover slips | Any brand | 22 x 22 mm No.1.5 | Use the thickness recommended by the microscope manufacturer. |
| compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives and filters to match the needs of the experiment. |
| media pump | Manostat Varistaltic pump | Kate model #72-620-000 |
Use tubing and settings appropriate for the machine |
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