हम अवगत में प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण के postembryonic नियामकों की पहचान विधि का वर्णन<em> सी. एलिगेंस</em> एक जीनोमिक आरएनएआई आधारित स्क्रीन और एक एकीकृत transgene कि एक कार्यात्मक, प्रोटीन fluorescently टैग व्यक्त का उपयोग.
सी एलिगेंस और कई जीनों और जीन एक रास्ते की खोज और कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली साबित हो गया है. अधिक परिष्कृत उपकरण और इस प्रणाली में अध्ययन के लिए संसाधनों का अधिक सूक्ष्म phenotypes या भूमिकाओं के साथ जीन की निरंतर खोज की सुविधा कर रहे हैं.
यहाँ हम हम सी. पहचान के लिए अनुकूलित एक सामान्यीकृत प्रोटोकॉल के वर्तमान 2 आरएनएआई का उपयोग ब्याज की postembryonic phenotypes साथ एलिगेंस जीन. इस प्रक्रिया को आसानी से पसंद की परख फेनोटाइप विदारक या यौगिक सूक्ष्मदर्शी पर प्रकाश या प्रतिदीप्ति प्रकाशिकी द्वारा, चाहे संशोधित किया गया है. इस स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के जीव के भौतिक संपत्ति और आणविक सी. उपकरण पर capitalizes एलिगेंस अनुसंधान समुदाय का उत्पादन किया गया है. एक उदाहरण के रूप में, हम एक एकीकृत transgene है कि एक आरएनएआई स्क्रीन में एक फ्लोरोसेंट उत्पाद व्यक्त के उपयोग के प्रदर्शन के लिए इस के सामान्य स्थानीयकरण के लिए आवश्यक जीन की पहचानदेर चरण लार्वा और वयस्कों में उत्पाद. सबसे पहले, हम पूरी लंबाई सीडीएनए आवेषण के साथ एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जीनोमिक आरएनएआई पुस्तकालय का इस्तेमाल किया. इस पुस्तकालय उम्मीदवार जीन उत्पाद की आरएनएआई कमी से कई उम्मीदवारों की तेजी से पहचान की सुविधा है. दूसरा, हम एक एकीकृत transgene है कि एक आरएनएआई संवेदनशील पृष्ठभूमि में हमारे हित के fluorecently टैग प्रोटीन व्यक्त उत्पन्न. तीसरा, आरएनएआई रची जानवरों को उजागर करने के द्वारा, इस स्क्रीन उत्पादों है कि एक महत्वपूर्ण भ्रूण भूमिका है कि अन्यथा ब्याज की प्रोटीन को विनियमित करने में एक भूमिका के बाद भ्रूण मुखौटा होता है जीन की पहचान करने की अनुमति देता है. अन्त में, इस स्क्रीन एक यौगिक एकल कक्ष संकल्प के लिए सुसज्जित खुर्दबीन का उपयोग करता है.
आरएनएआई स्क्रीनिंग विधि यहाँ प्रस्तुत जीन एक सामान्य (या ट्रांसजेनिक) के postembryonic phenotype के लिए आवश्यक उत्पादों की एक संवेदनशील और तेजी से विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है. उदाहरण दिखाया एक प्रोटीन fluorescently टैग क?…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों DBL 1 सीडीएनए और एक इंजेक्शन मार्कर के लिए डॉ. क्रिस्टोफर Rongo (Waksman संस्थान, Rutgers विश्वविद्यालय, न्यू जर्सी) के उपहार के लिए डा. रिक Padgett (Waksman संस्थान, Rutgers विश्वविद्यालय, न्यू जर्सी) को धन्यवाद देना चाहूंगा. डा. बार्थ अनुदान प्रयोगशाला GFP टैग DBL-1 का निर्माण कम प्रतिलिपि संख्या एकीकरण के लिए जीन बंदूक बमबारी प्रदर्शन किया. रेने गार्सिया प्रयोगशाला texIs100 के निर्माण के दौरान तकनीकी सहायता प्रदान की है. रेने गार्सिया, Robyn Lints के के, Hongmin और किन प्रयोगशालाओं उत्पादक सलाह प्रदान की है. यह काम शुरू हुआ धन द्वारा TAMHSC सेलुलर और आण्विक चिकित्सा विभाग से वित्त पोषित किया गया था. परिसर गुंजाइश और कताई डिस्क confocal विभाग और चिकित्सा डीन के कार्यालय की TAMHSC कॉलेज द्वारा प्रदान की गई धनराशि के साथ खरीदे थे.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
NGM Agar | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc | Can be prepared following NGM agar protocol25 |
M9 Medium | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4 |
26 | |
Agar-Agar | EMD Chemicals Inc. | 1.01614.1000 | 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter). |
Bacto Peptone | Becton Dickinson – Difco CP | 211677 | 0.25% |
IPTG | Research Products International Corp. | I56000-5.0 | 1 mM final concentration |
carbenicillin | Research Products International Corp. | C46000-5.0 | 50 μg/ml working dilution |
LB Broth Lennox | Becton Dickinson – Difco CP | 240230 | 20 g/liter |
tetracycline | Sigma | 268054 | 12.5 μg/ml working dilution |
sodium hypochlorite | Any brand | 5% household bleach | Use fresh bleach. |
sodium hydroxide | Any Brand | CAS 1310-73-2 | 5 N stock |
M9 medium | Wormlab Recipe Book | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab | 26 |
levamisol | Sigma | 31742 | 100 μM – 1 mM working dilution |
sodium azide | Fisher Scientific | S227 | 10 mM in M9 working dilution |
24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | VWR distributor |
microscope slides | Any brand | 75 x 25 x 1 mm | |
microscope cover slips | Any brand | 22 x 22 mm No.1.5 | Use the thickness recommended by the microscope manufacturer. |
compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives and filters to match the needs of the experiment. |
media pump | Manostat Varistaltic pump | Kate model #72-620-000 |
Use tubing and settings appropriate for the machine |