の後胚表現型を識別するためのRNAiスクリーニング C.エレガンス</em
Summary
我々は、タンパク質の発現と局在の後胚レギュレータを識別するための増感方法について説明します。<em> C.エレガンス</em> RNAiベースゲノムの画面と機能的な、蛍光標識タンパク質を発現する統合された遺伝子を使用します。
Abstract
線虫C. elegansは、多くの遺伝子や遺伝子経路1の発見と機能解析のための貴重なモデルシステムであることが判明した。このシステムでは、研究のためのより洗練されたツールやリソースは、より微妙な表現型またはロールを持つ遺伝子の継続的な発見を容易にしています。
ここで我々はCを識別するための適応一般的なプロトコルを提示RNAiの2を使用して関心の後胚の表現型を有する線虫の遺伝子。この手順は、簡単にかどうかを解剖または化合物を顕微鏡の光や蛍光光学系により、アッセイの選択肢の表現に変更されます。このスクリーニングのプロトコルは、生物の物理的な資産および分子ツールにCを大文字にelegansの研究コミュニティが生産している。例として、我々は、この通常のローカライズに必要な遺伝子を識別するために、RNAiスクリーニングの蛍光産物を発現する統合されたトランスジーンの使用方法を示してい後期幼虫と成虫の製品。まず、完全長cDNAインサートを市販のゲノムRNAiライブラリーを使用していました。このライブラリは、候補遺伝子産物のRNAi還元することにより複数の候補の迅速な同定を容易にします。第二に、我々はRNAiと小文字を区別し、バックグラウンドで興味のある私たちのfluorecentlyタグ付きタンパク質を発現する統合された導入遺伝子を生成します。第三に、RNAi実験に孵化した動物を曝すことによって、この画面では、そうでなければ、目的のタンパク質を調節するのに後胚の役割をマスクしたい重要な胚の役割を担っている遺伝子産物の同定を可能にします。最後に、この画面では、単一細胞の解像度のために装備の複合顕微鏡を使用しています。
Protocol
1。スクリーニング株の構築スクリーニング株の慎重なデザインは、画面を成功させるために重要であり、他の3に記載されている。一部の研究者については、導入遺伝子から見える産物を発現する菌株を使用することは実験のために必要とされる。統合された導入遺伝子を保有する多くの菌株は、CGCまたは個々の研究者から入手することができます。トランスジェ…
Discussion
ここで紹介するRNAiスクリーニング方法は、通常の（トランスジェニック）後胚表現型に必要な遺伝子産物の高感度で迅速な分析を可能にします。に示す例では、蛍光標識タンパク質の細胞内局在性に関与する遺伝子の画面です。しかし、このプロトコルは、関心のある他の後胚の表現型に影響を及ぼす遺伝子を同定するために変更することができます。
このメソッドは?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、注射マーカーのDBL-1のcDNAとDrクリストファー·ロンゴ（ワクスマン研究所、ラトガース大学、ニュージャージー州）の贈り物に博士リックパジェット（ワクスマン研究所、ラトガース大学、ニュージャージー州）に感謝したいと思います。博士バルトグラントの研究室は、GFPタグ付きDBL-1コンストラクトの低コピー数の統合のための遺伝子銃砲撃を行った。ルネ·ガルシア研究室では、texIs100の作成 中に技術支援を提供しました。ルネ·ガルシア、ロビンのLints、とHongmin秦研究所では、生産的なアドバイスを提供しました。この作品は、分子細胞医学のTAMHSC部からの起動資金によって賄われていた。化合物の範囲とスピニングディスク共焦点顕微鏡は、部門とディーン医学事務所のTAMHSC大学によって提供された資金で購入しました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| NGM Agar | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc | Can be prepared following NGM agar protocol25 |
| M9 Medium | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4 |
26 | |
| Agar-Agar | EMD Chemicals Inc. | 1.01614.1000 | 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter). |
| Bacto Peptone | Becton Dickinson – Difco CP | 211677 | 0.25% |
| IPTG | Research Products International Corp. | I56000-5.0 | 1 mM final concentration |
| carbenicillin | Research Products International Corp. | C46000-5.0 | 50 μg/ml working dilution |
| LB Broth Lennox | Becton Dickinson – Difco CP | 240230 | 20 g/liter |
| tetracycline | Sigma | 268054 | 12.5 μg/ml working dilution |
| sodium hypochlorite | Any brand | 5% household bleach | Use fresh bleach. |
| sodium hydroxide | Any Brand | CAS 1310-73-2 | 5 N stock |
| M9 medium | Wormlab Recipe Book | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab | 26 |
| levamisol | Sigma | 31742 | 100 μM – 1 mM working dilution |
| sodium azide | Fisher Scientific | S227 | 10 mM in M9 working dilution |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | VWR distributor |
| microscope slides | Any brand | 75 x 25 x 1 mm | |
| microscope cover slips | Any brand | 22 x 22 mm No.1.5 | Use the thickness recommended by the microscope manufacturer. |
| compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives and filters to match the needs of the experiment. |
| media pump | Manostat Varistaltic pump | Kate model #72-620-000 |
Use tubing and settings appropriate for the machine |
References
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
- Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. 유전학. 157, 1217-1226 (2001).
- Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).
- Frokjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).
- Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
- Simmer, F. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants. 유전학. , (2011).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).
- Wang, D. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- Fraser, A. G. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development. 유전학. , 129-195 (1991).
- Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology. Genes & Development. 9, 956-971 (1995).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Savage-Dunn, C. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Qu, W. Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
- Nelson, M. D. A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, e1002010 (2011).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sarin, S., Prabhu, S., O’Meara, M. M., Pe’er, I., Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5, 865-867 (2008).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. 유전학. 77, 71-94 (1974).
Cite This Article
Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3442, doi:10.3791/3442 (2012).