RNAi Screening for å identifisere Postembryonic fenotyper i C. elegans</em
Summary
Vi beskriver en sensitivisert metode for å identifisere postembryonic regulatorer av protein uttrykk og lokalisering i<em> C. elegans</em> Med en RNAi-baserte genomisk skjerm og en integrert transgenet som uttrykker en funksjonell, fluorescently tagget protein.
Abstract
C. elegans har vist seg å være en verdifull modell system for oppdagelsen og funksjonell karakterisering av mange gener og gen stier 1. Mer sofistikerte verktøy og ressurser for studier i dette systemet legger til rette for fortsatt funn av gener med mer subtile fenotyper eller roller.
Her presenterer vi en generalisert protokoll vi tilrettelagt for identifisering C. elegans gener med postembryonic fenotyper av interesse å bruke RNAi to. Denne prosedyren er enkelt endres til analysen fenotypen av valget, enten ved lys eller fluorescens optikk på en dissekere eller sammensatt mikroskop. Dette screening protokollen kapitaliserer på de fysiske eiendeler i organismen og molekylære verktøy C. elegans forskningsmiljøet har produsert. Som et eksempel, demonstrerer vi bruk av en integrert transgenet som uttrykker en fluorescerende produkt i en RNAi skjermen for å identifisere gener som kreves for normal lokalisering av denneprodukt i sent stadium larver og voksne. Først brukte vi en kommersielt tilgjengelig genomisk RNAi bibliotek med full lengde cDNA innsatser. Dette biblioteket muliggjør rask identifisering av flere kandidater ved RNAi reduksjon av kandidaten genproduktet. Second, genererte vi en integrert transgenet som uttrykker vår fluorecently tagget protein av interesse i en RNAi-sensitive bakgrunn. Tredje, ved å utsette klekket dyr til RNAi, tillater dette skjermbildet identifisering av genprodukter som har en viktig embryonale rolle som ellers ville maskere en post-embryonisk rolle i regulering av protein av interesse. Til slutt bruker denne skjermen et sammensatt mikroskop utstyrt for enkelt celle oppløsning.
Protocol
Discussion
Den RNAi screening metoden presentert her gir en sensitiv og rask analyse av genprodukter som kreves for en normal (eller transgen) postembryonic fenotype. Eksempelet som vises er en skjerm for gener som er involvert i subcellulære lokalisering av en fluorescently tagget protein. Men dette kan protokollen endres for å identifisere gener som påvirker andre postembryonic fenotyper av interesse.
Denne metoden utnytter en kandidat genet tilnærming ved hjelp av en RNAi bibliotek. Videresend g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Dr. Rick Padgett (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) for gave dbl-1 cDNA og Dr. Christopher rongo (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) for en injeksjon markør. Dr. Barth Grants lab utført genet pistolen bombardementet for lavt kopi nummer integrering av GFP-merket dbl-1 konstruksjon. Den René Garcia laboratoriet gitt teknisk assistanse under opprettelsen av texIs100. Den René Garcia, Robyn Lints, og Hongmin Qin laboratorier gitt produktiv råd. Dette arbeidet ble finansiert av oppstart midler fra TAMHSC Institutt for molekylær-og Cellular Medicine. Den sammensatte omfang og spinning disk confocal ble kjøpt med midler gitt av instituttet og TAMHSC College of Medicine kontor Dean.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| NGM Agar | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc | Can be prepared following NGM agar protocol25 |
| M9 Medium | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4 |
26 | |
| Agar-Agar | EMD Chemicals Inc. | 1.01614.1000 | 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter). |
| Bacto Peptone | Becton Dickinson – Difco CP | 211677 | 0.25% |
| IPTG | Research Products International Corp. | I56000-5.0 | 1 mM final concentration |
| carbenicillin | Research Products International Corp. | C46000-5.0 | 50 μg/ml working dilution |
| LB Broth Lennox | Becton Dickinson – Difco CP | 240230 | 20 g/liter |
| tetracycline | Sigma | 268054 | 12.5 μg/ml working dilution |
| sodium hypochlorite | Any brand | 5% household bleach | Use fresh bleach. |
| sodium hydroxide | Any Brand | CAS 1310-73-2 | 5 N stock |
| M9 medium | Wormlab Recipe Book | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab | 26 |
| levamisol | Sigma | 31742 | 100 μM – 1 mM working dilution |
| sodium azide | Fisher Scientific | S227 | 10 mM in M9 working dilution |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | VWR distributor |
| microscope slides | Any brand | 75 x 25 x 1 mm | |
| microscope cover slips | Any brand | 22 x 22 mm No.1.5 | Use the thickness recommended by the microscope manufacturer. |
| compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives and filters to match the needs of the experiment. |
| media pump | Manostat Varistaltic pump | Kate model #72-620-000 |
Use tubing and settings appropriate for the machine |
References
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
- Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. 유전학. 157, 1217-1226 (2001).
- Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).
- Frokjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).
- Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
- Simmer, F. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants. 유전학. , (2011).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).
- Wang, D. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- Fraser, A. G. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development. 유전학. , 129-195 (1991).
- Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology. Genes & Development. 9, 956-971 (1995).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Savage-Dunn, C. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Qu, W. Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
- Nelson, M. D. A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, e1002010 (2011).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sarin, S., Prabhu, S., O’Meara, M. M., Pe’er, I., Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5, 865-867 (2008).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. 유전학. 77, 71-94 (1974).
