RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans</em
Summary
Nós descrevemos um método sensibilizada para identificar os reguladores pós-embrionário de expressão da proteína e localização no<em> C. elegans</em> Usando uma tela de genoma baseada em RNAi e um transgene integrado que expressa uma proteína fluorescente funcional marcada.
Abstract
C. elegans tem provado ser um sistema de modelo valioso para a descoberta e caracterização funcional de muitos genes e vias gene 1. Instrumentos mais sofisticados e recursos para estudos neste sistema estão facilitando a descoberta contínua de genes com fenótipos mais sutis ou funções.
Aqui nós apresentamos um protocolo generalizada, adaptado para a identificação de C. elegans genes com fenótipos pós-embrionário de interesse usando RNAi 2. Este procedimento é facilmente modificado para ensaio do fenótipo de escolha, seja por óptica de luz ou de fluorescência em um microscópio de dissecação ou composto. Este protocolo de triagem capitaliza os ativos físicos do organismo e ferramentas moleculares a C. elegans comunidade científica tem produzido. Como um exemplo, que demonstram o uso de um transgene integrado que expressa um produto fluorescente em uma tela RNAi para identificar genes necessários para a localização normal desteproduto em larvas fase tardia e adultos. Em primeiro lugar, utilizou-se uma biblioteca genómica comercialmente disponível RNAi com full-length inserções de ADNc. Esta biblioteca facilita a rápida identificação de vários candidatos por RNAi redução do produto do gene candidato. Em segundo lugar, gerou um transgene integrado que expressa nossa proteína fluorecently marcados de interesse em um fundo RNAi-sensível. Em terceiro lugar, por exposição dos animais a eclodidos RNAi, esta tela permitir a identificação de produtos de genes que desempenham um papel vital embrionário que de outra forma mascarar um papel pós-embrionário na regulação da proteína de interesse. Por último, este ecrã utiliza um microscópio composto equipado para a resolução de célula única.
Protocol
Discussion
O método de triagem RNAi aqui apresentado permite uma análise rápida e sensível de produtos de genes necessários para um fenótipo (ou transgénico) normal pós-embrionário. O exemplo mostrado é um ecrã para genes envolvidos na localização subcelular de uma proteína fluorescentemente marcado. No entanto, este protocolo pode ser modificado para identificar genes que afectam outros fenótipos pós-embrionário de interesse.
Este método tira proveito de uma abordagem do gene candida…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Rick Padgett (Instituto Waksman, Rutgers University, NJ) para o dom do dbl-1 cDNA e Christopher Dr. Rongo (Instituto Waksman, Rutgers University, NJ) para um marcador de injeção. O laboratório do Dr. Barth Grant realizou o bombardeio arma gene para a integração baixo número de cópias do GFP dbl-1 construto. O René Garcia laboratório forneceu assistência técnica durante a criação de texIs100. O René Garcia, lints Robyn, e Hongmin Qin laboratórios prestou assessoria produtivo. Este trabalho foi financiado por fundos start-up do Departamento TAMHSC de Medicina Molecular e Celular. O escopo composto e confocal girando do disco foram adquiridos com recursos fornecidos pelo departamento e do Colégio TAMHSC do Office Medicina do Dean.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| NGM Agar | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc | Can be prepared following NGM agar protocol25 |
| M9 Medium | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4 |
26 | |
| Agar-Agar | EMD Chemicals Inc. | 1.01614.1000 | 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter). |
| Bacto Peptone | Becton Dickinson – Difco CP | 211677 | 0.25% |
| IPTG | Research Products International Corp. | I56000-5.0 | 1 mM final concentration |
| carbenicillin | Research Products International Corp. | C46000-5.0 | 50 μg/ml working dilution |
| LB Broth Lennox | Becton Dickinson – Difco CP | 240230 | 20 g/liter |
| tetracycline | Sigma | 268054 | 12.5 μg/ml working dilution |
| sodium hypochlorite | Any brand | 5% household bleach | Use fresh bleach. |
| sodium hydroxide | Any Brand | CAS 1310-73-2 | 5 N stock |
| M9 medium | Wormlab Recipe Book | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab | 26 |
| levamisol | Sigma | 31742 | 100 μM – 1 mM working dilution |
| sodium azide | Fisher Scientific | S227 | 10 mM in M9 working dilution |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | VWR distributor |
| microscope slides | Any brand | 75 x 25 x 1 mm | |
| microscope cover slips | Any brand | 22 x 22 mm No.1.5 | Use the thickness recommended by the microscope manufacturer. |
| compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives and filters to match the needs of the experiment. |
| media pump | Manostat Varistaltic pump | Kate model #72-620-000 |
Use tubing and settings appropriate for the machine |
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