RNAi screening identifiera Postembryonic fenotyper i C. elegans</em
Summary
Vi beskriver en sensibiliserad metod för att identifiera postembryonic regulatorer av protein uttryck och lokalisering i<em> C. elegans</em> Med en RNAi-baserade genomisk skärm och en integrerad transgen som uttrycker en funktionell, fluorescensmärkta protein.
Abstract
C. elegans har visat sig vara en värdefull modellsystem för upptäckten och funktionell karakterisering av många gener och vägar gen 1. Mer sofistikerade verktyg och resurser för studier i detta system är att underlätta fortsatt upptäckten av gener med mer subtila fenotyper eller roller.
Här presenterar vi en generell protokoll vi anpassat för att identifiera C. elegans gener med postembryonic fenotyper av intresse att använda RNAi 2. Detta förfarande är lätt modifieras för att analysera fenotypen val, antingen genom ljus eller fluorescens optik på ett dissekerande eller förening mikroskop. Denna screening protokoll kapitaliserar på de fysiska tillgångar organismen och molekylära verktyg för C. elegans forskarsamhället har producerat. Som ett exempel, visar vi att använda en integrerad transgen som uttrycker en fluorescerande produkt i en RNAi avsökning för att identifiera gener som krävs för den normala lokalisering av dennaprodukt i sent skede larver och vuxna. Först använde vi ett kommersiellt tillgängligt genomiskt RNAi bibliotek med full längd cDNA insatser. Detta bibliotek underlättar snabb identifiering av flera kandidater RNAi reduktion av kandidaten genprodukten. För det andra genererade vi en integrerad transgen som uttrycker vårt fluorecently taggade proteinet av intresse i en RNAi-känslig bakgrund. Tredje genom att exponera skuggade djur RNAi tillåter denna skärm identifiering av genprodukter som har en viktig embryonal roll som annars skulle maskera en post-embryonal roll i regleringen proteinet av intresse. Slutligen använder denna skärm ett mikroskop utrustat för enskild cell upplösning.
Protocol
Discussion
Den RNAi screening metod som presenteras här ger en känslig och snabb analys av genprodukter som krävs för en normal (eller transgena) postembryonic fenotyp. Det visade exemplet är en skärm för gener som är involverade i den subcellulära lokaliseringen av en fluorescensmärkt märkt protein. Emellertid kan detta protokoll ändras för att identifiera gener som påverkar andra postembryonic fenotyper av intresse.
Denna metod utnyttjar en kandidat gen strategi med hjälp av en RNAi bi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr Rick Padgett (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) för gåva dbl-1 cDNA och Dr Christopher Rongo (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) för en injektion markör. Dr Barth Grant labb utförde bombningarna genkanonen för låg antal kopior integrering av GFP-märkta dbl-1-konstruktionen. Den René Garcia laboratoriet lämnat tekniskt bistånd under skapandet av texIs100. Den René Garcia, Robyn fluffmaterial och Hongmin Qin laboratorier som produktivt råd. Detta arbete har finansierats av nystartade medel från TAMHSC Institutionen för molekylär och cellulär medicin. Föreningen omfattning och spinning disk konfokala köptes med medel från institutionen och TAMHSC College of Medicine kontor dekanus.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| NGM Agar | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc | Can be prepared following NGM agar protocol25 |
| M9 Medium | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4 |
26 | |
| Agar-Agar | EMD Chemicals Inc. | 1.01614.1000 | 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter). |
| Bacto Peptone | Becton Dickinson – Difco CP | 211677 | 0.25% |
| IPTG | Research Products International Corp. | I56000-5.0 | 1 mM final concentration |
| carbenicillin | Research Products International Corp. | C46000-5.0 | 50 μg/ml working dilution |
| LB Broth Lennox | Becton Dickinson – Difco CP | 240230 | 20 g/liter |
| tetracycline | Sigma | 268054 | 12.5 μg/ml working dilution |
| sodium hypochlorite | Any brand | 5% household bleach | Use fresh bleach. |
| sodium hydroxide | Any Brand | CAS 1310-73-2 | 5 N stock |
| M9 medium | Wormlab Recipe Book | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab | 26 |
| levamisol | Sigma | 31742 | 100 μM – 1 mM working dilution |
| sodium azide | Fisher Scientific | S227 | 10 mM in M9 working dilution |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | VWR distributor |
| microscope slides | Any brand | 75 x 25 x 1 mm | |
| microscope cover slips | Any brand | 22 x 22 mm No.1.5 | Use the thickness recommended by the microscope manufacturer. |
| compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives and filters to match the needs of the experiment. |
| media pump | Manostat Varistaltic pump | Kate model #72-620-000 |
Use tubing and settings appropriate for the machine |
References
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
- Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. 유전학. 157, 1217-1226 (2001).
- Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).
- Frokjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).
- Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
- Simmer, F. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants. 유전학. , (2011).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).
- Wang, D. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- Fraser, A. G. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development. 유전학. , 129-195 (1991).
- Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology. Genes & Development. 9, 956-971 (1995).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Savage-Dunn, C. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Qu, W. Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
- Nelson, M. D. A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, e1002010 (2011).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sarin, S., Prabhu, S., O’Meara, M. M., Pe’er, I., Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5, 865-867 (2008).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. 유전학. 77, 71-94 (1974).
