Summary
Per seguire la progressione di una risposta immunitaria nel tempo all'interno del mouse stesso, linfonodi può essere sequenzialmente asportato chirurgicamente. Qui, si descrive come questa tecnica può essere eseguita.
Abstract
Nel campo della immunologia, per comprendere la progressione di una risposta immunitaria contro un vaccino, un'infezione o un tumore, la risposta viene spesso seguita nel tempo. Analogamente, lo studio dell'omeostasi linfocitaria esperimenti corso richiede tempo. Eseguire questi studi all'interno del mouse stesso è ideale per ridurre la variabilità sperimentale così come il numero di topi utilizzati. Il prelievo di sangue permette di effettuare esperimenti nel tempo, ma dà solo informazioni su linfociti circolanti e fornisce un numero limitato di celle 1-4. Dal linfociti circolanti attraverso il corpo e residente nei linfonodi hanno proprietà diverse, è importante esaminare entrambe le posizioni. La rimozione sequenziale dei linfonodi da un intervento chirurgico offre una opportunità unica di seguire una risposta immunitaria o l'espansione delle cellule immunitarie nel topo lo stesso nel tempo. Inoltre, questa tecnica si ottiene tra 1-2x10 6 cellule per linfonodo che è sufficiente a aerform caratterizzazione fenotipica e / o saggi funzionali. Sequential chirurgia linfonodo o linfoadenectomia è stato usato con successo da noi e altri 5-11. Qui, si descrive come i linfonodi inguinali brachiale e possono essere rimossi da una piccola incisione nella pelle di un mouse anestetizzati. Dal momento che l'intervento è superficiale e fatto rapidamente il mouse recupera molto velocemente, guarisce bene e non provare dolore eccessivo. Ogni secondo giorno, è possibile raccogliere uno o due linfonodi consentendo esperimenti andamento nel tempo. Questa tecnica è quindi adatto ad studiare le caratteristiche di linfonodi risiedono linfociti nel tempo. Questo approccio è adatto a vari disegni sperimentali e crediamo che molti laboratori trarrebbero beneficio da eseguire in sequenza operazioni linfonodali.
Protocol
1. Preparazione prima della chirurgia
I topi sono stati trattati in conformità al Consiglio canadese sugli orientamenti cura degli animali.
- Anestetizzare topi mediante iniezione di ketamina / xilazina (150/300 mg / kg, ip) o per inalazione di isoflurano (2%, ossigeno 1L). Se disponibile, isoflurano deve essere usato in quanto consente un migliore controllo del tempo anestesia e profondità. Inoltre, l'ossigeno viene somministrato al tempo stesso che sostiene le funzioni fisiologiche dell'animale. Inoltre, isoflurano è direttamente eliminato dai polmoni e quindi non richiede il metabolismo epatico o renale.
- Iniettare buprenorfina (0,05 - 0,1 mg / kg, sc) o un altro analgesico.
- Applicare una pomata per gli occhi del mouse prima di un intervento per evitare la secchezza oculare (se isoflurano è utilizzato).
- Verificare che il mouse è addormentato stringendo la zampa e rotolando la coda. Se il mouse non reagisce, procedere con la chirurgia.
2. La Chirurgia
- Mettere il mouse sul suo lato.
- Localizzare la regione in cui si effettuerà una incision, a seconda del LN da raccogliere. (Figura 1).
- Applicare clorexidina, o un altro disinfettante, a quella regione.
- Effettuare una piccola incisione con le forbici taglienti (circa 5 mm) o sul retro della zampa anteriore o sopra la zampa posteriore vicino al ventre (Figura 1).
- Rimuovere i peli si è tagliata con le pinzette. Se si preferisce, si può radere il mouse prima di effettuare l'incisione. Tuttavia, la procedura si allunga e si trova che non è necessario in quanto, come mostrato qui, non migliora infezione guarigione o diminuzione, che sono entrambi molto rare.
- Tendere l'incisione con 2 pinze in modo da vedere la LN. L'incisione può raggiungere i 10 mm. La LN appare grigiastro o più scura rispetto al grasso circostante.
- Premere la fascia (la membrana sottile e che copre il tessuto grasso) sopra la LN con una pinza e tirare leggermente senza rompere il tessuto circostante.
- Posizionare la pinza secondo quanto possibile underneath la LN. Con le pinze primi, rompere la fascia e rimuovere la LN. Se avete raccolto con successo la LN, una macchia di sangue dovrebbe apparire nel luogo in cui la LN è stata precedentemente posizionata. Si noti che i lavelli LN in soluzione isotonica. Questo semplice test permette di verificare che avete estratto uno LN e il tessuto non grasso.
- Verificare che non sono peli nella ferita.
- Chiudere il incisione attaccando le 2 parti di pelle insieme (all'interno della cute) e di pinzatura con una clip. Usiamo un po 'videoclip Michel con la pinza che si applicano. Installare uno o clip 2 a seconda delle dimensioni dell'incisione. Molto spesso, le clip cadere quando il tessuto guarisce.
3. Cura postoperatoria
- Aggiungere cibo umido al fondo della gabbia in modo che i topi possono alimentare facilmente dopo l'intervento.
- Circa 6 a 8 ore dopo l'intervento, controllare i topi per assicurarsi che non provano dolore. Osservare attentamente il loro comportamento (postura, andatura, ininterazione con il congenere e l'aspetto della pelliccia). Se l'aspetto generale dei topi è scarsa, somministrare una seconda dose di buprenorfina. Il giorno successivo i topi devono riconquistare il loro comportamento normale altrimenti continuare la somministrazione di buprenorfina. I topi non dovrebbe mai raggiungere i punti finali determinati in precedenza ed accettato dal Consiglio Animal Care. Si potrebbe desiderare di chiedere consiglio e aiuto dal vostro tecnico di vivarium cura degli animali.
4. Linfonodale Handling
- In laboratorio, per ottenere una sospensione di cellule singole, dissociare la LN secondo le normali procedure. Premiamo LN contro vetrini smerigliati e di routine ottenere 1-2 x 10 6 cellule per LN. In alternativa, si prepara la LN per l'estrazione di RNA.
- Colorare le cellule secondo il protocollo usuale. Si dovrebbe ottenere attesi LN profili di citometria a flusso.
5. Risultati rappresentativi
Un esempio di p scatter in avanti e lateralelotto viene mostrato per LNs raccolte da un topo anestetizzati mediante chirurgia o da un topo sacrificato (Figura 2). Il profilo e le percentuali di cellule nel cancello diretta dei linfociti sono gli stessi dimostrando che la chirurgia LN è una tecnica appropriata per cellule raccolto.
Figura 1. Inguinale e localizzazione LN brachiale nel topo. A. La LN inguinale si trova appena sopra la zampa posteriore, leggermente verso il ventre. B. La LN brachiale si trova dietro la zampa anteriore.
Figura 2. Profilo di citometria a flusso dei linfociti ottenuti dopo l'intervento LN. Profili forward scatter e lato sono indicati per LNs raccolte da un Anesthtopo etized chirurgicamente (A) o da un topo sacrificato (B). LNs sono state raccolte, dissociato e analizzati su un citometro a flusso. Percentuali di cellule del cancello vivo linfociti sono mostrati.
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Discussion
Abbiamo descritto un protocollo di chirurgia LN, che può essere applicato a molti sistemi sperimentali. Anche se molto utile per seguire le risposte immunitarie o omeostasi delle cellule immunitarie, questa tecnica ha alcune limitazioni. In primo luogo, solo quattro LNs può essere raccolto. In secondo luogo, la risposta immunitaria studiare deve essere sistemica o si verificano nelle superficiali inguinali o brachiale (pelle-drenante) LNS. Infine, il numero di cellule raccolte è influenzata dalla qualità della rimozione LN, una limitazione tecnica che può contribuire alla variabilità sperimentale quando i numeri di cella assoluti sono necessari. Tuttavia, la percentuale di cellule bersaglio, per sé, può fornire informazioni pertinenti e precise dimensioni LN in particolare quando non varia attraverso varie condizioni sperimentali. Fortunatamente, una volta che la tecnica è ben padroneggiata, la qualità di rimozione LN migliora, consentendo il numero delle cellule altamente riproducibili in ogni LN. Noi crediamo che, nonostante queste limitazioni, la chirurgia LN fornisce vantaggi per studiarela progressione di risposte immunitarie. Innanzitutto, la risposta immunitaria nel tempo possono essere monitorati in un topo determinata, diminuendo variabilità sperimentale così come il numero di topi utilizzati. In secondo luogo, eventi quali omeostasi linfociti o apertura risposta immunitaria si verificano nelle LNs possono essere direttamente studiata. Un altro grande vantaggio è che più le cellule possono essere recuperati da LNs che dal sangue permettendo per la caratterizzazione delle cellule esteso. Questa tecnica è adatta anche per altri fini, quali genotipizzazione topi transgenici o studiare altre popolazioni di cellule che risiedono o il traffico attraverso le LNs come le cellule B, cellule dendritiche ei macrofagi.
Il nostro laboratorio e altri hanno usato questa tecnica per diversi anni e non abbiamo mai osservato alcuna interferenza sul corso della risposta immunitaria 7-9,12,13 e sulla omeostasi immunitaria 5-7. Chirurgia LN sequenziale a riposo wild-type C57BL / 6 topi non ha influenzato la percentuale e il numero di CD4 + + 5-7. Inoltre, inoltre, non ha influenzato questi parametri nei LNs residue. Inoltre, nel corso di una risposta immunitaria, rimozione LN superficiale non ha influenzato le cinetiche della risposta di cellule T né la generazione di cellule T di memoria 8,9,12,13. Inoltre, confronto fianco a fianco della risposta delle cellule T sia seguita da un intervento chirurgico LN sequenziale o sacrificato mouse non ha evidenziato differenze nelle nostre mani (risultati non pubblicati e Figura 2). Pertanto, chirurgia LN sequenziale è adatto per lo studio delle cellule T e omeostasi risposta.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo Lesage Sylvie e tutti i membri di laboratorio per la lettura critica del protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa (MOP-77545) dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Nathalie Labrecque è supportato da una borsa di studio FRSQ Senior e Mélissa Mathieu ha ricevuto una NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Graefe Fine Pattern Premium Forceps | Harvard Apparatus | 52-2144 | Strongly Curved, 10 cm (4 in), 0.8 mm tip |
| Michel Clip Applying and Removing Forceps | Harvard Apparatus | 52-3779 | 12.5 cm (5 in) |
| Michel Clip 100 | Harvard Apparatus | 52-3746 | 7.5-1.75 mm |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Merck & Co. | ||
| Vetalar (Ketamine hydrochloride) | Bioniche Animal Health | DIN: 01989529 | |
| Rompun (Xylazine) | Bayer AG | DIN: 02169592 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | DIN: 02032384 | |
| Hypotears eye ointment | Novartis AG | DIN: 02133288 | |
| Baxedin (Clorhexidine gluconate 2% in isopropyl alcohol 70%) | Omega Engineering, Inc. | L0000017 | DIN: 02251477 |
References
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