والانشطار الخميرة ،<em> Schizosaccharomyces pombe</em> ، هو نظام نموذجا جيدا لدراسة العمليات الخلوية الأساسية. نحن هنا وصف طريقة التحليل الكمي لأداء الخلية الحية من الخميرة الانشطار. في هذه التجربة خاصة ونحن نركز على تنظيم الجينوم داخل نواة الخلية ، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم أسلوب لدراسة العوامل عصاري خلوي.
المجهري تقنيات عدة متوافرة اليوم التي يمكن الكشف عن بروتين معين داخل الخلية. خلال العقد الماضي أصبح يعيش التصوير الخلية باستخدام fluorochromes مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) يعلق مباشرة على البروتين من الاهتمام الشعبي على نحو متزايد 1. ويمكن استخدام GFP fluorochromes مماثلة يتم الكشف عن اللغات المحلية التحت خلوية وتحركات البروتينات في المجهر الفلورسنت. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا أن تدرس توطين subnuclear في منطقة معينة من الكروموسوم باستخدام هذه التقنية. وتنصهر GFP للبروتين كاظمة لاك (LacR) ، وأعرب عن ectopically في الخلية حيث تم إدخال يكرر جنبا إلى جنب من تسلسل lacO في المنطقة ذات الاهتمام على الكروموزوم 2. سوف LacR – GFP ربط lacO ويكرر هذا المجال من الجينوم سيكون مرئيا باعتبارها نقطة خضراء في مضان المجهر. وهي ملائمة بشكل خاص الخميرة لهذا النوع من التلاعب منذ مثليوالتوحد هو فعالة جدا ويمكن بالتالي التكامل المستهدفة من يكرر lacO والبروتينات الانصهار هندسيا مع GFP 3. نحن هنا وصف الأسلوب الكمي لتحليل الخلية الحية من الخميرة الانشطار. ويمكن الاطلاع على بروتوكولات إضافية لتحليل الخلية الحية من الخميرة الانشطار ، على سبيل المثال على كيفية صنع فيلم من 4 السلوك الكروموسومات الانتصافي. في هذه التجربة خاصة ونحن نركز على تنظيم subnuclear وكيف يتأثر أثناء تحريض الجينات. وصفت لنا كتلة الجين المسمى Chr1 ، عن طريق استحداث مواقع lacO ملزمة في المنطقة المجاورة للجينات. غير المخصب الكتلة الجين لجينات التي يسببها الجوع في وقت مبكر خلال النيتروجين من الخميرة الانشطار 5. في سلالة يسمى الغشاء النووي (NM) عن طريق الحجز على mCherry إلى NM Cut11 البروتين مما يؤدي إلى الإشارات الحمراء الفلورسنت. وتنصهر في الجسم القطب المغزل (SPB) مجمع Sid4 لبروتين فلوري الأحمر (Sid4 – mRFP) 6 </sيصل>. في خلايا الخميرة نباتيا المتزايدة هي التي تعلق دائما centromeres إلى SPB مضمن في شمال البحر الأبيض المتوسط 7. تم تحديد هيكل وSPB جولة واسعة في شمال البحر الأبيض المتوسط. بواسطة التصوير قبل وبعد 20 دقيقة من مصدر استنزاف النيتروجين يمكننا تحديد المسافة بين الكتلة الجين (GFP) وNM / SPB. وتتم مقارنة المسافات يعني أو الوسيط قبل وبعد استنفاد النيتروجين ، ويمكننا بالتالي تحديد ما إذا كان أو لم يكن هناك تحولا في توطين التحت خلوية من الكتلة الجين بعد استنفاد النيتروجين.
خلال العقد الماضي أصبح استخدام التصوير الخلية الحية لرصد الأحداث الخليوي شعبية متزايدة. بدأ ذلك مع استخدام البروتين الإسفار الأخضر من قنديل البحر Aequorea فيكتوريا والآن fluorochromes مختلفة كثيرة متاحة مضان ينبعث منها من خلال أطياف واسعة من السماوي (475 نانومتر) إلى اللون الأحمر حتى الآن (648 نانومتر) 11. واحد من أهم مزايا التصوير الخلية الحية عبر المناعي هو أنه لم يتم إصلاح الخلايا الفورمالديهايد أو المعاملة الايثانول / الأسيتون قبل المجهري ، وبالتالي تجنب القطع الممكنة من عملية التثبيت. بالإضافة إلى ذلك ، يعيش التصوير الخلية توفر إمكانية تتبع الخلايا الفردية ، والتقاط الصور على فترات متكررة خلال ساعات أو أيام من الحضانة ، مما يجعل من الممكن الحصول على الأفلام من الأحداث الخلوية 12. خلايا الثدييات لديها ميزة وجود حجم أكبر ، ويبلغ قطرها حوالي 100 ميكرون ، بالمقارنة مع خلايا الخميرة الصغيرة التي يبلغ قطرها حوالي 3-4 ومو ؛ متر. من ناحية أخرى ، فإن الميزة مع الخميرة الجينوم هو التلاعب بسهولة. مثلي تأشب يحدث بكفاءة عالية في الخميرة ، ويستخدم لفتيل البروتينات التي تهم مختلف fluorochromes 3. وعلاوة على ذلك ، وذلك باستخدام التكامل المستهدف لمتواليات lacO والتعبير لاحقة من البروتين GFP – LacR يسمح للكشف عن جزء معين من الجينوم داخل نواة الخلية 2. باستخدام S. خلايا pombe في المجهر ومزايا إضافية لأنها كائنات وحيدة الخلية الطبيعية التي تنمو مع الوقت جيل السريع في الظروف منخفضة التكلفة ثقافة الخلية. وعلاوة على ذلك ، S. pombe ممتازة الكائنات حقيقية النواة نموذج له منذ metazoan الجينات المتماثلة.
واحدة من القيود الرئيسية لهذا الأسلوب هو تألق ذاتي في خلية الخميرة مزعجة للكشف عن إشارة حقيقية. ويمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق استخدام وسائط النمو مع الحد الأدنى من الجلوكوز تعقيم تصفية بدلا من تعقيمها. فيبالإضافة إلى ذلك ينبغي أن تزرع في خلايا الخميرة لمدة 2 يوما في المرحلة قبل التركيب سجل لهم. بروتوكول المعروضة هنا يقدم طريقة بسيطة نسبيا ، ولكن حتى الآن لتحديد الكمية توطين التحت خلوية من البروتينات داخل الخلية الخميرة. وعلاوة على ذلك عن طريق التقاط الصور عند نقاط زمنية مختلفة يمكننا متابعة الأحداث الخلوية.
The authors have nothing to disclose.
نشكر الأستاذ هيراوكا لارسال لنا السلالات. نعترف بدعم من مؤسسة Gustafssons غوران وجمعية السرطان سويدية (2008/939).
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comment |
Lectin | Sigma | L1395 | |
Silicon grease | Dow Corning | ||
Laser scanning microscope LSM 700 |
Zeiss | LSM 700 | Other confocal microscope could be used. |
SigmaStat3.5 | Statcon | SigmaStat3.5 | Any software for statistical analysis could be used. |