Elektrofysiologische karakterisatie van GFP-uitdrukken celpopulaties in de Intact Retina

Summary

Dit artikel geeft de registratie van de individuele cellen van fluorescent gelabelde neuronale populaties in het intacte muis netvlies. Door het gebruik van twee-foton excitatie infrarood transgenetically gelabelde cellen waren gericht voor patch-clamp opnamen om hun licht te antwoorden, receptieve veld eigenschappen, en morfologie studie.

Abstract

Het bestuderen van de fysiologische eigenschappen en synaptische verbindingen van specifieke neuronen in de intact weefsel is een uitdaging voor die cellen die opvallende morfologische kenmerken ontbreken of tonen een lage bevolkingsdichtheid. Dit geldt vooral voor het netvlies amacrine cellen, een buitengewoon pluriforme klasse van interneuronen dat ongeveer 30 subtypes bij zoogdieren ^een omvatten. Ondanks dat een cruciaal onderdeel van de visuele verwerking door het vormgeven van de retina uitgang ^2, zijn de meeste van deze subtypes niet bestudeerd tot nu toe in een functionele context, want de komst van deze cellen met een registratie-elektrode is een zeldzame gebeurtenis.

Onlangs heeft een veelheid van transgene muis lijnen beschikbaar die uitdrukken fluorescerende markers, zoals groen fluorescerend eiwit (GFP) onder de controle van promotoren voor membraan receptoren of enzymen die specifiek zijn voor slechts een subset van neuronen in een bepaald weefsel ^3,4. Deze pre-gelabelde cellen zijn dus accessible aan gerichte micro-elektrode te richten onder microscopische controle, waardoor de systematische studie van hun fysiologische eigenschappen in situ. Echter, is de excitatie van fluorescerende markers begeleid door het risico van fototoxiciteit voor het levend weefsel. In het netvlies, is deze aanpak bovendien gehinderd door het probleem dat excitatielicht juiste stimulatie van de fotoreceptoren oorzaken, dus het toebrengen van photopigment bleken en het overbrengen van de retina circuits in een licht aangepaste conditie. Deze nadelen worden ondervangen door met behulp van infrarood excitatie geleverd door een geblokkeerde modus laser in korte pulsen van de femtoseconde bereik. Twee-foton excitatie levert energie voldoende voor fluorofoor excitatie en op hetzelfde moment beperkt de opwinding tot een klein volume weefsel het minimaliseren van de gevaren van zonbeschadigde ^5. Ook laat het netvlies reageren op visuele stimuli, aangezien infrarood licht (> 850 nm) is slechts in geringe mate geabsorbeerd door photopigments ^6.

<p class = "jove_content"> In dit artikel tonen we het gebruik van een transgene muis netvlies te elektrofysiologische te bereiken in situ opnames van GFP-expressie brengen die visueel het doelwit zijn van twee-foton excitatie. Het netvlies is bereid en in stand gehouden in de duisternis en kan worden onderworpen aan optische stimuli die volgens de prognoses door de condensor van de microscoop (figuur 1). Patch-clamp-opname van het licht de reacties kan worden gecombineerd met kleurstof vullen van de morfologie te openbaren en te controleren op gap junction-gemedieerde kleurstof koppeling aan naburige cellen, zodat de doelcel kan door bestudeerd op verschillende experimentele niveaus.

Protocol

De volgende beschrijving wordt ervan uitgegaan dat de experimentator een basiskennis van het netvlies structuur, de patch-clamp-opname, en twee-foton microscopie is. Voor nuttige informatie over het opzetten en runnen van een patch-clamp installatie en twee-foton imaging-systeem te zien Refs [7-12]. 1. Dier-en het prepareren van weefsels Houd de muis donker aangepast voor minstens 3 uur In de tussentijd bereiden 1-2 L van extracellulaire oplossing bestaande uit (in mm) 125 NaCl, KCl 2,5, 1 CaCl 2, 1,6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 10 D-glucose en evenwicht dat tot pH 7,4 door middel van vergassing met carbogen (5% CO 2 in O 2) bij kamertemperatuur. een Euthanaseren van de muis in een luchtdichte kamer van CO 2 een overdosis, gevolgd door cervicale dislocatie. Deze procedure en de volgende stappen moeten worden uitgevoerd in het donker. Gebruik dim lange golflengte verlichting (we blokkeren korte golflengten van een koude lichtbron met een 690 nm-longpass filter) om persoonlijke visie te ondersteunen terwijl het dier in de ogen aan het donker aangepaste (muizen alleen slecht zicht in het rode deel van het lichtspectrum). Voor het werk in volledige duisternis gebruik van infrarood verlichting (> 800 nm) en slijtage night-vision goggles. Ophelderen ogen met een paar van gebogen iris schaar en overbrengen naar een gerecht van extracellulaire oplossing onder een dissectie microscoop. Verwijder het hoornvlies en corpus ciliare door het openen van de ogen bol langs de ora serrata (de grens tussen netvlies en corpus ciliare) met een paar van de lente schaar (we eerst een lancet te gebruiken om doorboren een startpunt voor het snijden). Haal de lens en het netvlies zorgvuldig gescheiden van het pigment epitheel. Als de richting van het netvlies is cruciaal voor je studie, het als aangeven in Ref [12]. Snijd de optische zenuw tussen netvlies en pigment epitheel en verwijder het netvlies van de oogschelp. Let op de richting van de retinale oppervlakken: de binnenkant van de gekrulde-up netvlies is het Ganglion cel kant, de buitenkant is de fotoreceptor kant. Verwijder het glasvocht van het netvlies binnenste oppervlak door het voorzichtig uit met de hulp van een houten tandenstoker. Hiervoor gebruikt u een klein volume van de extracellulaire oplossing die alleen maar dekt het netvlies. Het glasvocht houdt zich aan de tandenstoker en kan centrifugaal worden weggesleept het netvlies. Dan, van toepassing korte insnijdingen langs de retinale omtrek te faciliteren afvlakking van het weefsel. Overdracht van het netvlies in de opname kamer fotoreceptor naar beneden, spreid het uit op de glazen bodem (we gebruiken een fijn penseel) en met een nylon-geregen frame van roestvrij staal te immobiliseren. Bereid de tweede netvlies op dezelfde manier en houd het donker aangepast carboxygenated extracellulaire oplossing voor later gebruik. 2. Opnamen Installeer de opname kamer in het donker onder een rechte laser scanning microscoop en continu superfuse de retinale bereiding (niet minder dan 5 ml / min) met carboxygenated extracellulaire oplossing verwarmd tot 35 ° C. De microscoop (ook uitgerust met een infrarood-gevoelige CCD-camera) is gelegen op een schokabsorberende lucht tafel in een kooi van Faraday voor elektronische afscherming. Dek de kooi met een niet-transparant gordijn aan de voorbereiding te houden in de duisternis. We hebben ook af te schermen licht van computer-monitoren door rode transparante film. Tune de infrarood laser om 850 tot 870 nm of langere golflengten, overschakelen naar en geblokkeerde modus staat, en twee-foton excitatie aan GFP-expressie brengende cellen te visualiseren gebruiken. Het verkleinen van de laser-uitvoer via grijsfilters gecontroleerd door de laser scanning software naar beneden in een mate die is net voldoende voor de duidelijke erkenning van de fluorescerende cel Voor de patch-clamp opnamen in de huidige-clamp modus glas micropipetten (we gebruiken borosilicaatglas buis van 1,5 mm diameter en 0.225 mm wanddikte) gevuld met intracellulaire oplossing die bestaat uit (in mm) 125 K-gluconaat, 10 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, getitreerd tot pH 7,4 met KOH (het geven van een pipet weerstand van ongeveer 5 MΩ). Merk op dat andere experimentele condities, zoals voltage-clamp het opnemen van een andere oplossing nodig. Als kleurstof injecties gewenst zijn, voeg een fluorescente probe (we gebruiken 10 mM Alexa Fluor 594) of een tracer molecule (3% Neurobiotin). Steek de micropipet in de houder en zorg ervoor dat de referentie-elektrode (gechloreerde zilver draad) in contact komt met de extracellulaire oplossing in de opname kamer. Druk op de micropipet en gericht op een GFP expressie cel (wij gebruiken een 40-voudige water immersie objectief, NA 1.25). Amacrine cellichamen zijn gelegen in het ganglion cellaag (direct onder de oppervlakte in de huidige oriëntatie van het netvlies) als in het proximale deel van de binnenste nucleaire laag (ongeveer 55 tot 75 micrometer diep in de voorbereiding). Voordat micropipet contact met de beoogde cel, de binnenste beperken membraan (een omhulling van gliale endfeet) op het netvliesoppervlak moet worden doorgedrongen. Succesvolle penetratie is erkend door intracellulaire oplossing die wordt verdreven uit het micropipet tip en los de binnenste membraan van het beperken van het onderliggende retinaal weefsel als kunnen worden waargenomen op een infrarood transmissie beeld dat met de IR-CCD camera. Aanpak van de gewenste cel door het vergelijken van de soma positie van de twee-foton beeld met de afbeelding van de IR-CCD camera die de positie van de opname micropipet. Merk op dat deze stap niet gemakkelijk bereikt en vergt enige oefening, want de GFP expressie cel moet worden erkend in het infrarood transmissie afbeelding om de micropipet direct naar toe. De juiste targeting is bereikt wanneer de micropipet tip oorzaken kuiltjes van het celoppervlak die kan worden gezien in de twee-foton beeld. Alternatief voor deze procedure, gebruik dan een fluorescerende kleurstof (bv. Alexa Fluor 594, 100 uM) in de intracellulaire oplossing voor de micropipet positie zien in de twee-foton image. Twee-foton excitatie infrarood zorgt voor voldoende fluorescentie van deze kleurstof om de micropipet waarneembaar. Voor dit doel, past u de detectie-bereik in de laser scanning software uit te breiden tot rode fluorescentie. Laat de druk van de micropipet en het verkrijgen van een whole-cell patch-clamp-configuratie in de huidige-klem-modus. Een bruikbare opname moet geven een membraanpotentiaal van -50 tot -55 mV en voor ten minste 20 minuten. Aanwezig zijn visuele stimuli gecreëerd door een stimulatie software (we gebruiken QDS door Thomas Euler, Universiteit van Tübingen, Duitsland), 11 op een computer monitor. Pas de ruimtelijke positie van de stimulatie te midden van de opgenomen cel: Markeer de cel positie op de monitor met de overdracht beeld van de IR-CCD-camera en in het midden een spot-als stimulus op het. Stem de stimulus intensiteit door het invoegen van grijsfilters in de straal pad. Voor het kalibreren van de monitor spectrum en intensiteit zie ref [14]. Kies een prolonged interstimulus interval (bv. 15 s) om de aanpassing te voorkomen. Neem een ​​fotodiode in de straal weg naar record van de stimulus timing te houden. Start de stimulatie protocol en noteer de lichte reacties (we gebruiken een samplefrequentie van 10 kHz met een filtering op 5 kHz voor niet-stekelige cellen; voor spike het opnemen van een hogere sampling rate als 20 kHz wordt aanbevolen). Gebruik het licht stimulatie software om de opname-software te activeren. Voor het vullen van kleurstof laat de fluorescerende stof diffunderen in de opgenomen cel voor 30-45 min voor zorgvuldig het terugtrekken van de micropipet van de cel. Zorg ervoor dat niet te trekken uit het cellichaam. Als de niet-fluorescerende tracer Neurobiotin werd gebruikt, moet visualisatie door binding aan streptavidine geconjugeerd aan een fluorofoor (we gebruiken streptavidine-Cy3, 1:400 gedurende de nacht bij 4 ° C na 20 min paraformaldehyde fixatie van het netvlies, voor dye-koppeling studies streptavidine incubatie kan worden verlengd tot 3 d). Als alternatief kunnen injecties ook worden uitgevoerd metscherpe elektroden (> 100 MΩ) wanneer de kleurstof iontophoretically wordt gedreven in de gespietst cel (rechthoekige pulsen: 0.25-1 nA, 100 ms, interval 100 ms, totale tijd 3-6 min). 3. Representatieve resultaten: De volgende resultaten zijn afkomstig van een studie over een muis te drukken groen fluorescerend eiwit (GFP) in het kader van de promotor voor tyrosine hydroxylase 13,14, het enzym katalyseert de snelheidsbepalende stap in catecholamine synthese (TH:: GFP muis). Op basis van de helderheid van het GFP-signaal twee verschillende celpopulaties worden onderscheiden (figuur 2A). Cellen die het hogere niveau beschikken over GFP cellichamen gelegen in de binnenste nucleaire laag (INL, figuur 2A) of verplaatst in het ganglion cellaag (GCL, figuur 2B) en stratificeren in het midden van de binnenste laag plexiform (IPL, figuur 2C) . Zij werden geïdentificeerd als type 2-cellen 14-16 en kan systematisch worden bestudeerd met betrekking tot de morfologie (Figuur 3) en te kiezenrical activiteit (figuur 4), hoewel de bevolkingsdichtheid bedraagt ​​slechts 250 cellen / mm 2. Figuur 1. Schematische weergave van de experimentele opstelling. Twee-foton excitatie (rode stippellijn licht pad) van fluorofoor expressie cellen in het netvlies intact laat visuele targeting op basis van een micropipet (groen emissie lichtpad). Het netvlies wordt blootgesteld aan optische stimuli geprojecteerd door de condensor van de microscoop (gele lichtpad), en cellulaire lichte reacties zijn opgenomen. Figuur 2. GFP-expressie brengen in een retinale flatmount van een TH:: GFP muis. Twee populaties kan worden onderscheiden door de helderheid van het GFP-signaal: type 1 cellen (DA cellen) gelegen in het INL met een zwakke fluorescentie (A, zie pijlpunten) en intens gelabeld type 2-cellenmet cellichamen, hetzij in het INL (A, zie pijlen) of ontheemden in de GCL (B) en een dendritische gelaagdheid in stratum S3 van de IPL (C). Schaal van bars, 50 um. Figuur 3. Morfologie van een type 2 cel geïnjecteerd met de tracer Neurobiotin. De tracer werd vervolgens gevisualiseerd door streptavidine-Cy3 binding (magenta). De microfoto, die ook beeltenis van de GFP-signaal (groen), is een projectie van het beeld stapels met betrekking tot de GCL-en IPL. Schaalbalk, 50 um. Figuur 4. Licht de antwoorden van een type 2 cel bevindt zich in het GCL. Reactie patroon naar wit licht full-field verlichting van toenemende intensiteit in de scotopische bereik. Stimulus intensiteit wordt gegeven in photoisomerizations per staaf per seconde (Rh * / staaf / s). Een langdurige stimulans van 3 s werd gebruikt voor een betere verschillendeion van de respons componenten op stimulus onset (de respons) en offset (OFF respons).

Discussion

Deze methode biedt de mogelijkheid om elektrische eigenschappen van bepaalde neuronen in de retina intact onder visuele begeleiding bestuderen, zonder beïnvloeding van de adaptational conditie van het netvlies. Het is met name geschikt voor de karakterisering van de cellen die zijn op dit moment nogal slecht bestudeerd vanwege de lage bevolkingsdichtheid zoals de meeste populaties van amacrine cellen. Twee-foton excitatie maakt hoge resolutie en hoog contrast beeldvorming zelfs vanuit diepere delen van het weefsel ^17, een voorwaarde voor nauwkeurige targeting en succesvolle patch-spannen van cellen met name in de INL met zijn hoge dichtheid van cellichamen.

De geïsoleerde muis netvlies is haalbaar voor 3-4 uur onder de experimentele omstandigheden. Als de tweede netvlies wordt opgeslagen in volledige duisternis onder voortdurende carbogen vergassing, behoudt de paarse kleur van ongebleekte photopigment en kan gebruikt worden na het beëindigen van experimenten met de eerste netvlies. In het begin, gericht op degeselecteerde cel met de micropipet in de retinale wholemount is een beetje uitdagend en vereist enige oefening, vooral bij het werken in het donker. Inclusief een fluorescerende kleurstof in het micropipet kan vereenvoudiging van de procedure, omdat de cel en micropipet zijn zichtbaar onder twee-foton excitatie op hetzelfde moment. Echter, kan het toevoegen van componenten aan de intracellulaire oplossing belemmeren gigaseal vorming of kan de opnamekwaliteit te lijden. Een keer met succes, kan een goede opname duurt ongeveer 1 uur

Overwegende dat de infrarood-excitatie licht zelf is slechts in geringe mate geabsorbeerd door het netvlies fotoreceptoren, opgewonden GFP-expressie cellen licht uitstralen in het zichtbare deel van het spectrum. Echter, fluoroforen enthousiast slechts in een klein brandpunt volume dat niet waarschijnlijk is de adaptational toestand van het netvlies te veranderen. Des te meer, excitatie is alleen nodig voor het richten en kan worden uitgeschakeld tijdens het opnemen van het licht de reacties.

De usefulness van deze aanpak is al aangetoond door studies over specifieke populaties van cellen amacrine ^14,18 uit die anders elektrofysiologische opnames mogelijk zou zijn alleen per ongeluk ^12. Tot slot kan deze krachtige techniek verder worden uitgebreid door het opnemen van een farmacologische benadering ^14, Ca ^{2 +} imaging ¹⁹ of met behulp van ingespoten cellen voor immunocytochemische studies of elektronenmicroscopie. Op die manier kan de functionele positie van een bepaald celtype in de retinale circuits worden ontrafeld.

Materials

Reagent/Equip-ment	Company	Catalogue number	Comments
Night-vision goggles	Gutzeit GmbH, Warthausen, Germany	Xtron F1	includes a 800 nm light source
Optical filter	Schott, Mainz, Germany	RG9	longpass filter with cutoff at 690 nm
Iris scissors	Fine Science Tools	14061-09	curved with 22 mm blade
Spring scissors	Fine Science Tools	15000-00	straight with 3 mm blade
Recording chamber	Luigs & Neumann GmbH, Ratingen, Germany	200-100 500 0180 type A(TC)	Teflon chamber with bottom-mounted glass cover slip (approx. 0.15 mm; No. 200-100 500 0182)
Flow heater	Multichannel Systems, Reutlingen, Germany	PH01, TC01	heatable perfusion cannula with temperature sensor and temperature controller
Laser scanning microscope	Leica Microsystems	DM LFS	controlled by Leica Confocal Software
Air table	Newport	VH 3036W-OPT
Laser	Spectra-Physics		Tsunami Mode-locked Ti:sapphire laser
CCD camera	pco AG, Kelheim, Germany	PixelFly QE	including control software
Micropipette glass capillaries	Hilgenberg, Malsfeld, Germany	1408411
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004	fluorescent dye
Neurobiotin	Axxora	VC-SP-1120-M050	non-fluorescent tracer
Streptavidin-Cy3	Dianova	016-160-084
Micromanipulator	Luigs & Neumann GmbH, Ratingen, Germany	210-100 000 0010	motorized Mini25 manipulator unit with display SM-5
Patch-clamp amplifier	npi electronic GmbH, Tamm, Germany	SEC-05LX npi
Digitizer	National Instruments	BNC-2090
Data acquisition software WinWCP	John Dempster, University of Scotland, Glasgow, UK		http://spider.science.strath. ac.uk/sipbs/ software.htm
Visual stimulus generator QDS	Thomas Euler, University of Tübingen, Germany		has to be operated on a separate computer controlling 2 monitors (user interface, stimulus monitor)
Neutral density filters	ITOS, Mainz, Germany