Detta manuskript beskriver tre kompletterande protokoll för att bedöma toxicitet polyglutaminsystem (polyQ)-expansion proteiner i jästen<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. Dessa protokoll kan lätt modifieras för att övervaka toxiciteten hos andra felveckade proteiner i jäst.
Protein felveckning förknippas med många sjukdomar hos människan, i synnerhet neurodegenerativa sjukdomar, såsom Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom och Huntingtons sjukdom 1. Huntingtons sjukdom (HD) är orsakad av onormal utvidgning av en polyglutaminsystem (polyQ) regionen i proteinet huntingtin. Den polyQ-expanderade huntingtin protein uppnår en avvikande konformation (dvs det misfolds) och orsakar cellulär toxicitet 2. Minst ytterligare åtta neurodegenerativa sjukdomar orsakas av polyQ-expansioner, inklusive spinocerebellära ataxi och Kennedys sjukdom 3.
Modellen organismen jästen har underlättat betydande insikter i cellulära och molekylära grunden för polyQ-toxicitet, inklusive effekten av intra-och inter-molekylära faktorer polyQ-toxicitet, och identifieringen av cellulära vägar som är osäkra i celler som uttrycker polyQ expansion proteiner 3-8. Viktigtly har många aspekter av polyQ-toxicitet som hittades i jäst återges i andra experimentella system och i viss utsträckning i prover från HD patienter, vilket visar betydelsen av jästen modell för upptäckten av grundläggande mekanismer som ligger till grund polyQ-toxicitet.
En direkt och relativt enkelt sätt att bestämma polyQ-toxicitet i jäst är att mäta tillväxtdefekter av jästceller som uttrycker polyQ expansion proteiner. Detta manuskript beskriver tre komplementära experimentella metoder för att bestämma polyQ-toxicitet i jäst genom att mäta tillväxt av jästceller som uttrycker polyQ expansion proteiner. De två första experimentella metoder att övervaka jäst tillväxt på plattor, övervakar tredje metoden tillväxten av flytande jästkulturer använder BioscreenC instrumentet.
Vidare beskriver detta manuskript experimentella svårigheter som kan uppstå vid hantering av modellerna jäst polyQ och beskriver strategier som bidrar till att undvika ellerminimera dessa svårigheter. De protokoll som beskrivs här kan användas för att identifiera och karakterisera genetiska vägar och små molekyler som modulerar polyQ-toxicitet. Vidare kan de beskrivna analyserna tjäna som mallar för noggranna analyser av toxicitet orsakad av andra sjukdomar associerade med felveckade proteiner i jäst modeller.
Detta manuskript beskriver tre kompletterande experimentella metoder för att mäta polyQ-toxicitet i modellen organismen jästen baserat på minskad tillväxt av jästceller som uttrycker giftiga polyQ expansion proteiner. Arbetet i jäst har erbjudit djupa insikter om de grundläggande cellulära och molekylära mekanismer av protein felveckning och dess påföljande toxicitet, inklusive felveckning och toxicitet polyQ expansion proteiner 9,11,12. Experiment bygger på de protokoll som presenteras här har …
The authors have nothing to disclose.
Arbetet i Duennwald laboratoriet stöds med bidrag från den amerikanska Federation for Aging Research (FJÄRRAN), den ärftliga sjukdomen Foundation (HDF) och William Wood Foundation.
Name of instrument | Company | Catalogue number |
Frogger (6×8 pins) | V&P Scientific, San Diego | VP 407 AH |
BioscreenC | Growthcurves USA | 5101370 |
100-well Honeycomb plates | Growthcurves USA | 9602550 |