Dette håndskrift beskriver tre komplementære protokoller for at vurdere toksiciteten af polyglutamine (polyQ)-ekspansion proteiner i gær<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. Disse protokoller kan let modificeres til at overvåge toksicitet andre fejlfoldede proteiner i gær.
Protein fejlfoldning er forbundet med mange humane sygdomme, især neurodegenerative sygdomme, såsom Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom og Huntingtons sygdom 1. Huntingtons sygdom (HD) er forårsaget af unormal vækst af en polyglutamine (polyQ) region i proteinet huntingtin. Den polyQ-ekspanderet huntingtin protein opnår en afvigende kropsbygning (dvs. den misfolds) og forårsager cellulær toksicitet 2. Mindst otte yderligere neurodegenerative sygdomme skyldes polyQ-udvidelser, herunder spinocerebellar ataksi og Kennedys sygdom 3.
Modellen organisme gær har lettet betydeligt indsigt i cellulære og molekylære grundlag for polyQ-toksicitet, inklusive virkningen af intra-og inter-molekylære faktorer polyQ-toksicitet, og identifikation af cellulære veje, der er svækkede i celler, som udtrykker polyQ-udvidelse proteiner 3-8. Vigtigtly blev mange aspekter af polyQ-toksicitet, der blev fundet i gær er gengivet i andre eksperimentelle systemer og i nogen udstrækning i prøver fra HD-patienter, hvilket viser betydningen af gærmodel for opdagelsen af grundlæggende mekanismer underbygger polyQ-toksicitet.
En direkte og relativt enkel måde at bestemme polyQ-toksicitet i gær er at måle vækstdefekter af gærceller, der udtrykker polyQ-ekspansion proteiner. Dette skrift beskriver tre komplementære eksperimentelle fremgangsmåder til at bestemme polyQ-toksicitet i gær ved at måle væksten af gærceller, der udtrykker polyQ-ekspansion proteiner. De første to eksperimentelle tilgange overvåge gær vækst på plader, den tredje tilgang overvåger væksten af flydende gær kulturer ved hjælp af BioscreenC instrument.
Desuden er denne manuskript beskriver eksperimentelle vanskeligheder, der kan opstå ved håndtering af gær polyQ modeller og skitserer strategier, der vil bidrage til at undgå ellerminimere disse problemer. Protokollerne der er beskrevet her, kan anvendes til at identificere og karakterisere genetiske veje og små molekyler, der modulerer polyQ-toksicitet. Desuden kan de beskrevne assays tjener som templates for nøjagtige analyser af toksicitet forårsaget af andre sygdom-associerede fejlfoldede proteiner i gær modeller.
Dette håndskrift skitserer tre komplementære eksperimentelle metoder til at måle polyQ-toksicitet i model organisme gær baseret på reduceret vækst af gærceller, der udtrykker giftige polyQ-ekspansion proteiner. Arbejde i gær har tilbudt dybtgående indsigt i de grundlæggende cellulære og molekylære mekanismer af protein misfoldning og dens efterfølgende toksicitet, herunder misfoldning og toksicitet af polyQ-ekspansion proteiner 9,11,12. Eksperimenter baseret på de protokoller, der præsenteres h…
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet i Duennwald laboratoriet er støttet af tilskud fra American Federation for Aldringsforskning (Afar), den arvelige sygdom Foundation (HDF) og William Wood Foundation.
Name of instrument | Company | Catalogue number |
Frogger (6×8 pins) | V&P Scientific, San Diego | VP 407 AH |
BioscreenC | Growthcurves USA | 5101370 |
100-well Honeycomb plates | Growthcurves USA | 9602550 |