Biz bitki protein-protein etkileşimleri test etmek için bir teknik geliştirdik. Sarı floresan protein (YFP) örtüşmeyen iki parça halinde bölünmüş durumda. Her parçası füzyon proteinleri ifade sağlayan, Gateway sistemi üzerinden ilgi bir gen-frame klonlanmış. YFP sinyal Sulandırma sadece tahkikat proteinler etkileşime girdiğinde oluşur.
Abstract
Biz, in vivo olarak iki protein arasındaki etkileşimi test etmek için bir BiFC tekniği geliştirdik . Bu örtüşmeyen iki parçalara bölme sarı floresan protein (YFP) tarafından gerçekleştirilir. Her parçası ilgi bir gen-frame klonlanmış. Bu yapılardan sonra, füzyon proteinleri transit ifade izin Agrobacterium aracılı dönüşüm yoluyla Nicotiana benthamiana içine ortak dönüştürülmüş olabilir. YFP sinyal sulandırıldıktan sadece tahkikat proteinleri 1-7 etkileşime girdiğinde oluşur. BiFC protein-protein etkileşimleri test etmek ve doğrulamak için, maya iki hibrid (Y2H) tayini ile birlikte kullanıldığında olabilir. Bu Y2H göz ardı edilebilir dolaylı etkileşimleri algılayabilir. Ağ Geçidi teknoloji, servis ilgi gen (GOI) araştırmacıları, evrensel bir platformda pek çok ifade ve mümkün 8,9 olarak fonksiyonel analiz sistemleri. Her iki yönelim ve okuma çerçevesini ifade hazır klonları yapmak için restriksiyon enzimleri veya ligasyonu kullanmadan muhafaza edilebilir. Sonuç olarak, bir deneyler boyunca tutarlı sonuçları elde etmek için yeniden sıralama adımları ortadan kaldırabilir. Biz, hem de BiFC ve Y2H testleri gerçekleştirmek için 10 kolay kullanımlı araçları ile araştırmacılara Ağ Geçidi uyumlu BiFC ve Y2H vektörler bir dizi oluşturduk . Burada, N. protein-protein etkileşimleri test etmek için BiFC sistemini kullanarak kolaylığı göstermek benthamiana bitkiler.
Protocol
1. Agrobacterium kültür hazırlanması Agrobacterium suşu GV3101 önceden Ağ Geçidi uyumlu BiFC vektör pEarleyGate201-YC ve pEarleyGate202-YN, her bir füzyon GOI inşa içeren ile değiştirdi. BiFC füzyon proteini bir 5 ml YEB (5g L -1 Sığır özü, 1g L -1 Maya özü, 5g L -1 Peptonlu, 5g L -1 Sakkaroz, 2mm MgSO 4, pH 7,2) kültür İnokülasyon ile Agrobacterium dönüştürülmüş yapıları uygun antibi…
Discussion
BiFC tahlil protein etkileşimleri çalışmak için güçlü bir araçtır. BiFC geleneksel Y2H testinin aksine, sadece protein-protein etkileşimleri görselleştirme sağlar, ama aynı zamanda alt hücresel yerleşimi gibi protein kompleksi daha fazla bilgi sağlar. Ayrıca, iki aday proteinler üçüncü bir ortağı tarafından yeterince yakın getirilebilir olarak sürece dolaylı etkileşimleri tespit etmek mümkündür. Herhangi bir teknoloji gibi, BiFC sınırlamaları vardır. BiFC fluorofor oluşumu için mol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi Nguyen Biz el yazması ve genel laboratuvar yardım okuma için teşekkür ederim.
Tian, G., Lu, Q., Zhang, L., Kohalmi, S. E., Cui, Y. Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System. J. Vis. Exp. (55), e3473, doi:10.3791/3473 (2011).