In dit protocol combineren we RNAi-gemedieerde gensilencing een<em> In vivo</em> Diurese test om de effecten knockdown van genen van belang te bestuderen heeft op muggen vloeistof excretie.
Deze video protocol geeft blijk van een effectieve techniek om een bepaald gen in een insect knockdown en voert een nieuwe bioassay om de uitscheiding te meten. Deze methode kan worden gebruikt om een beter begrip van de werkwijze volgens diurèse in insecten verkrijgen en is bijzonder nuttig bij het bestuderen van diurèse in bloed geeft geleedpotigen die kunnen nemen grote hoeveelheden vloeistof in een bloedmaaltijd.
Deze RNAi-gemedieerde gen-knockdown in combinatie met een in vivo diurese test werd ontwikkeld door de Hansen lab om de effecten van RNAi-gemedieerde knockdown van aquaporine genen op Aedes aegypti mug diurese 1 te bestuderen.
Het protocol is ingesteld in twee delen: de eerste demonstratie laat zien hoe een eenvoudige injectie mug apparaat te maken en hoe voor te bereiden en dsRNA te injecteren in de thorax van muggen voor RNAi-gemedieerde gen knockdown. De tweede demonstratie illustreert hoe bepalenuitscheiding prijzen voor muggen met behulp van een in vivo bioassay.
De gebruikte RNAi-protocol is ontwikkeld in het laboratorium van Alexander Raikhel aan de Universiteit van Californië Riverside 6,7 en is vergelijkbaar met een protocol gepubliceerd door Garver en Dimopoulos 4. De experimentele benadering in deze video protocol kan worden gebruikt om genen in insect diurèse in een in vivo studie omgeving. De uitscheidingsorganen van insecten, de buisjes van Malpighi, hebben de interesse van de generaties van onderzoekers als een 'simpele' modelsy…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken Victoria Carpenter voor haar kritische opmerkingen van dit protocol.
Name of reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
MEGAscript T7 High Yield Kit | Ambion, Inc. | AM1334 | |
PBS buffer | Sigma-Aldrich | P4417 | |
Plastic tubing | Local vendor | PVC | |
1 ml plastic pipette tip | VWR | 83007-376 | Blue tip |
1 ml syringe | Becton, Dickinson and Company | 309602 | |
Scissors | Local vendor | ||
Metal needle | Carolina Biologicals | 654307 | Size 5 |
Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
Battery-powered aspirator w/ collection vial | UPMA Labs | IPMM 2000 | |
Fine tip forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
Glass capillary needles | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
Analytical precision balance | Mettler Toledo | AB54S | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
One pint waxed lined cardboard cups | Local vendor | Manufactured soup cups | |
Mesh net | Local vendor | plastic fly gauze |