RNAi בתיווך ג'ין מציאה ו<em> In vivo</em> Diuresis Assay ב נקבה בוגרת<em> Aedes aegypti</em> יתושים
Summary
בפרוטוקול זה אנו משלבים RNAi בתיווך להשתקת גנים עם<em> In vivo</em> Assay diuresis ללמוד מציאה השפעות של גנים של עניין יש על הפרשת נוזל יתושים.
Abstract
זה פרוטוקול וידאו מדגים טכניקה יעילה מציאה גן מסוים חרק ולנהל המבדק חדשנית למדוד את קצב הפרשת. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי להשיג הבנה טובה יותר של תהליך diuresis ב חרקים שימושית במיוחד בחקר diuresis בדם, האכלה פרוקי רגליים כי הם מסוגלים לקחת כמויות עצומות של נוזל הדם בארוחה אחת.
מציאה זו RNAi בתיווך גנים בשילוב עם ב assay diuresis vivo פותחה על ידי המעבדה הנסן כדי לחקור את ההשפעות של מציאה RNAi בתיווך של גנים אקווה פורין על diuresis Aedes יתוש aegypti 1.
הפרוטוקול מוגדר ב-לשני חלקים: ההפגנה הראשונה מדגים כיצד לבנות מכשיר פשוט זריקה יתוש וכיצד להכין ולהזריק dsRNA לתוך בית החזה של יתושים על מציאה RNAi בתיווך גנים. הפגנה 2 מתארת כיצד לזהותוהפרשה שיעורי יתושים באמצעות המבדק ב vivo.
Protocol
Discussion
פרוטוקול RNAi משמש פותחה במעבדה של אלכסנדר Raikhel באוניברסיטת קליפורניה בריברסייד 6,7, והוא דומה הפרוטוקול שפורסם על ידי Garver ו Dimopoulos 4. הגישה הניסיונית המוצגת פרוטוקול הווידאו הזאת יכולה לשמש כדי לחקור גנים המעורבים diuresis חרק בסביבה vivo. איברי ההפרשה של חרק?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים ויקטוריה קרפנטר להערות ביקורתיות שלה של פרוטוקול זה.
Materials
| Name of reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| MEGAscript T7 High Yield Kit | Ambion, Inc. | AM1334 | |
| PBS buffer | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Plastic tubing | Local vendor | PVC | |
| 1 ml plastic pipette tip | VWR | 83007-376 | Blue tip |
| 1 ml syringe | Becton, Dickinson and Company | 309602 | |
| Scissors | Local vendor | ||
| Metal needle | Carolina Biologicals | 654307 | Size 5 |
| Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
| Battery-powered aspirator w/ collection vial | UPMA Labs | IPMM 2000 | |
| Fine tip forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Glass capillary needles | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Analytical precision balance | Mettler Toledo | AB54S | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| One pint waxed lined cardboard cups | Local vendor | Manufactured soup cups | |
| Mesh net | Local vendor | plastic fly gauze |
References
- Drake, L. L., et al. The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 5, e15578 (2010).
- Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA efficacy determination. Analytical biochemistry. 344, 287-288 (2005).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic acids research. 25, 3389-3402 (1997).
- Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).
- Clements, A. N. Volume 1 Development, Nutrition, and Reproduction. The Biology of Mosquitoes. 2, (1992).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10626-10631 (2004).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito. The Journal of biological chemistry. 280, 20565-20572 (2005).
- Pannabecker, T. Physiology of the Malpighian Tubule. Annual review of entomology. 40, 493-510 (1995).
- Dow, J. New insights into Malpighian tubule function from functional genomics. Comp Biochem Phys A. 150, S135 (2008).
- Dow, J. A. T. Insights into the Malpighian tubule from functional genomics. Journal of Experimental Biology. 212, 435-445 (2009).
- Lawson, D., et al. VectorBase: a data resource for invertebrate vector genomics. Nucleic acids research. 37, 583-587 (2009).
- Beyenbach, K. W. Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects. J. Exp. Biol. 206 (Pt 21), 3845-3856 (2003).
- Coast, G. M. Continuous recording of excretory water loss from Musca domestica using a flow-through humidity meter: hormonal control of diuresis. Journal of insect physiology. 50, 455-468 (2004).
- Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding. FEBS letters. 585, 3507-3512 (2011).
- Hays, A. R., Raikhel, A. S. A novel protein produced by the vitellogenic fat body and accumulated in mosquito oocytes. Development Genes and Evolution. 199, 114-121 (1990).
