RNAi-mediert Gene knockdown og<em> In Vivo</em> Diurese Assay i voksen hunn<em> Aedes aegypti</em> Mygg
Summary
I denne protokollen kombinerer vi RNAi-mediert genet Silencing med en<em> In vivo</em> Diurese analysen for å studere effekter knockdown av gener av interesse har på mygg væske utskillelse.
Abstract
Denne videoen protokollen demonstrerer en effektiv teknikk for å knockdown et bestemt gen i en insekt og gjennomføre en roman bioassay å måle utskillelse rate. Denne metoden kan brukes til å oppnå en bedre forståelse av prosessen diurese i insekter og er spesielt nyttig i studiet av diuresen i blod som ammer leddyr som er i stand til å ta opp store mengder væske i et enkelt måltid blod.
Dette RNAi-mediert genet knockdown kombinert med en in vivo diurese analysen ble utviklet av Hansen lab for å studere effektene av RNAi-mediert knockdown av aquaporin gener på Aedes aegypti mygg diurese en.
Protokollen er oppsettet i to deler: den første demonstrasjonen illustrerer hvordan å konstruere en enkel mygg injeksjon enhet og hvordan man forbereder og injisere dsRNA inn thorax av mygg for RNAi-mediert genet knockdown. Den andre demonstrasjonen viser hvordan du finnerutskillelse priser i mygg ved hjelp av en in vivo bioassay.
Protocol
Discussion
Den RNAi protokollen som brukes er utviklet i laboratoriet av Alexander Raikhel ved University of California Riverside 6,7 og ligner på en protokoll publisert av Garver og Dimopoulos 4. Den eksperimentelle tilnærmingen vist i denne videoen protokollen kan brukes til å studere gener involvert i insekt diurese i en in vivo setting. De ekskresjonsfunksjoner organer insekter, de Malpighian tubuli, har tiltrukket seg interesse av generasjoner av forskere som en "enkel" modell syste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Victoria Carpenter for hennes kritiske kommentarer av denne protokollen.
Materials
| Name of reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| MEGAscript T7 High Yield Kit | Ambion, Inc. | AM1334 | |
| PBS buffer | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Plastic tubing | Local vendor | PVC | |
| 1 ml plastic pipette tip | VWR | 83007-376 | Blue tip |
| 1 ml syringe | Becton, Dickinson and Company | 309602 | |
| Scissors | Local vendor | ||
| Metal needle | Carolina Biologicals | 654307 | Size 5 |
| Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
| Battery-powered aspirator w/ collection vial | UPMA Labs | IPMM 2000 | |
| Fine tip forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Glass capillary needles | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Analytical precision balance | Mettler Toledo | AB54S | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| One pint waxed lined cardboard cups | Local vendor | Manufactured soup cups | |
| Mesh net | Local vendor | plastic fly gauze |
References
- Drake, L. L., et al. The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 5, e15578 (2010).
- Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA efficacy determination. Analytical biochemistry. 344, 287-288 (2005).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic acids research. 25, 3389-3402 (1997).
- Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).
- Clements, A. N. Volume 1 Development, Nutrition, and Reproduction. The Biology of Mosquitoes. 2, (1992).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10626-10631 (2004).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito. The Journal of biological chemistry. 280, 20565-20572 (2005).
- Pannabecker, T. Physiology of the Malpighian Tubule. Annual review of entomology. 40, 493-510 (1995).
- Dow, J. New insights into Malpighian tubule function from functional genomics. Comp Biochem Phys A. 150, S135 (2008).
- Dow, J. A. T. Insights into the Malpighian tubule from functional genomics. Journal of Experimental Biology. 212, 435-445 (2009).
- Lawson, D., et al. VectorBase: a data resource for invertebrate vector genomics. Nucleic acids research. 37, 583-587 (2009).
- Beyenbach, K. W. Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects. J. Exp. Biol. 206 (Pt 21), 3845-3856 (2003).
- Coast, G. M. Continuous recording of excretory water loss from Musca domestica using a flow-through humidity meter: hormonal control of diuresis. Journal of insect physiology. 50, 455-468 (2004).
- Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding. FEBS letters. 585, 3507-3512 (2011).
- Hays, A. R., Raikhel, A. S. A novel protein produced by the vitellogenic fat body and accumulated in mosquito oocytes. Development Genes and Evolution. 199, 114-121 (1990).
