RNAi-опосредованной Нокдаун гена и<em> В Vivo</em> Анализ Диурез в взрослых женщин<em> Aedes aegypti</em> Комары
Summary
В этом протоколе мы объединим RNAi-опосредованной генов с<em> В естественных условиях</em> Диурез анализ, чтобы изучить эффекты нокдауна генов интерес имеет на комаров выделение жидкости.
Abstract
Это видео демонстрирует протокол эффективный метод, чтобы нокдаун гена в частности насекомых и провести новые биопроб для измерения скорости экскреции. Этот метод может быть использован для получения более глубокого понимания процесса диурез у насекомых и особенно полезен при изучении диурез в питающимися кровью членистоногих, которые могут занимать огромное количество жидкости в одной еды кровь.
Это RNAi-опосредованной генной нокдаун в сочетании с в тесте диурез естественных условиях была разработана Хансен лабораторию для изучения влияния RNAi-опосредованной нокдаун аквапорин генов комара Aedes aegypti диурез 1.
Протокол установки из двух частей: первая демонстрация показывает, как построить простое устройство инъекции комаров и, как подготовить и ввести в дсРНК грудной клетки комаров для RNAi-опосредованной генной нокдаун. Вторая демонстрация показывает, как можно определитьвыделение ставок в использовании комаров в естественных условиях биопроб.
Protocol
Discussion
Протокол RNAi использоваться была разработана в лаборатории Александр Райхель из Университета Калифорнии Riverside 6,7 и похож на протокол опубликован Гарвер и Dimopoulos 4. Экспериментальный подход показано в этом видео, протокол может быть использован для изучения генов, участвующи?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность Виктории Карпентер ее критические замечания этого протокола.
Materials
| Name of reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| MEGAscript T7 High Yield Kit | Ambion, Inc. | AM1334 | |
| PBS buffer | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Plastic tubing | Local vendor | PVC | |
| 1 ml plastic pipette tip | VWR | 83007-376 | Blue tip |
| 1 ml syringe | Becton, Dickinson and Company | 309602 | |
| Scissors | Local vendor | ||
| Metal needle | Carolina Biologicals | 654307 | Size 5 |
| Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
| Battery-powered aspirator w/ collection vial | UPMA Labs | IPMM 2000 | |
| Fine tip forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Glass capillary needles | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Analytical precision balance | Mettler Toledo | AB54S | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| One pint waxed lined cardboard cups | Local vendor | Manufactured soup cups | |
| Mesh net | Local vendor | plastic fly gauze |
References
- Drake, L. L., et al. The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 5, e15578 (2010).
- Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA efficacy determination. Analytical biochemistry. 344, 287-288 (2005).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic acids research. 25, 3389-3402 (1997).
- Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).
- Clements, A. N. Volume 1 Development, Nutrition, and Reproduction. The Biology of Mosquitoes. 2, (1992).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10626-10631 (2004).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito. The Journal of biological chemistry. 280, 20565-20572 (2005).
- Pannabecker, T. Physiology of the Malpighian Tubule. Annual review of entomology. 40, 493-510 (1995).
- Dow, J. New insights into Malpighian tubule function from functional genomics. Comp Biochem Phys A. 150, S135 (2008).
- Dow, J. A. T. Insights into the Malpighian tubule from functional genomics. Journal of Experimental Biology. 212, 435-445 (2009).
- Lawson, D., et al. VectorBase: a data resource for invertebrate vector genomics. Nucleic acids research. 37, 583-587 (2009).
- Beyenbach, K. W. Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects. J. Exp. Biol. 206 (Pt 21), 3845-3856 (2003).
- Coast, G. M. Continuous recording of excretory water loss from Musca domestica using a flow-through humidity meter: hormonal control of diuresis. Journal of insect physiology. 50, 455-468 (2004).
- Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding. FEBS letters. 585, 3507-3512 (2011).
- Hays, A. R., Raikhel, A. S. A novel protein produced by the vitellogenic fat body and accumulated in mosquito oocytes. Development Genes and Evolution. 199, 114-121 (1990).
