RNAi-mediated gene Knockdown och<em> In Vivo</em> Diures Analys hos vuxna kvinnliga<em> Aedes aegypti</em> Myggor
Summary
I detta protokoll kombinerar vi RNAi-medierad geners uttryck med en<em> In vivo</em> Diures analys för att studera effekterna knockdown av gener av intresse har på mygg vätskeutsöndringen.
Abstract
Denna video protokollet visar en effektiv teknik för att knockdown en viss gen i en insekt och genomföra en ny bioassay för att mäta utsöndringshastighet. Denna metod kan användas för att erhålla en bättre förståelse av förfarandet enligt diures hos insekter och är speciellt användbar vid studier av diures i livnär sig på blod artropoder som har förmåga att ta upp stora mängder av vätska i en enda blodmjöl.
Detta RNAi-medierad gen knockdown i kombination med en in vivo-diures analys har utvecklats av Hansen labbet för att studera effekterna av RNAi-medierad knockdown av aquaporin gener på Aedes aegypti mygga diures 1.
Protokollet är inställt i två delar: den första demonstrationen visar hur man konstruerar en enkel anordning mygga injektion och hur man förbereder och injicerar dsRNA i bröstkorgen av myggor för RNAi-medierad gen knockdown. Den andra demonstrationen visar hur man bestämmerutsöndringshastigheter i myggor som använder en in vivo-bioanalys.
Protocol
Discussion
Det RNAi protokoll som används har utvecklats i laboratoriet Alexander Raikhel vid University of California Riverside 6,7 och liknar ett protokoll publicerats av Garver och Dimopoulos 4. Den experimentella metoden visad i denna video protokoll kan användas för att studera gener involverade i insekts diures i en in vivo-miljö. Utsöndringsorganen av insekter, de Malpighian tubuli, har väckt intresse hos generationer av forskare som en "enkel" modell för diures. Detta organ ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Victoria snickare för hennes kritiska kommentarer i detta protokoll.
Materials
| Name of reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| MEGAscript T7 High Yield Kit | Ambion, Inc. | AM1334 | |
| PBS buffer | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Plastic tubing | Local vendor | PVC | |
| 1 ml plastic pipette tip | VWR | 83007-376 | Blue tip |
| 1 ml syringe | Becton, Dickinson and Company | 309602 | |
| Scissors | Local vendor | ||
| Metal needle | Carolina Biologicals | 654307 | Size 5 |
| Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
| Battery-powered aspirator w/ collection vial | UPMA Labs | IPMM 2000 | |
| Fine tip forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Glass capillary needles | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Analytical precision balance | Mettler Toledo | AB54S | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| One pint waxed lined cardboard cups | Local vendor | Manufactured soup cups | |
| Mesh net | Local vendor | plastic fly gauze |
References
- Drake, L. L., et al. The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 5, e15578 (2010).
- Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA efficacy determination. Analytical biochemistry. 344, 287-288 (2005).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic acids research. 25, 3389-3402 (1997).
- Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).
- Clements, A. N. Volume 1 Development, Nutrition, and Reproduction. The Biology of Mosquitoes. 2, (1992).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10626-10631 (2004).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito. The Journal of biological chemistry. 280, 20565-20572 (2005).
- Pannabecker, T. Physiology of the Malpighian Tubule. Annual review of entomology. 40, 493-510 (1995).
- Dow, J. New insights into Malpighian tubule function from functional genomics. Comp Biochem Phys A. 150, S135 (2008).
- Dow, J. A. T. Insights into the Malpighian tubule from functional genomics. Journal of Experimental Biology. 212, 435-445 (2009).
- Lawson, D., et al. VectorBase: a data resource for invertebrate vector genomics. Nucleic acids research. 37, 583-587 (2009).
- Beyenbach, K. W. Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects. J. Exp. Biol. 206 (Pt 21), 3845-3856 (2003).
- Coast, G. M. Continuous recording of excretory water loss from Musca domestica using a flow-through humidity meter: hormonal control of diuresis. Journal of insect physiology. 50, 455-468 (2004).
- Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding. FEBS letters. 585, 3507-3512 (2011).
- Hays, A. R., Raikhel, A. S. A novel protein produced by the vitellogenic fat body and accumulated in mosquito oocytes. Development Genes and Evolution. 199, 114-121 (1990).
