Tissue Forberedelse og immunfarvning af Mouse sensoriske nervefibre innerverer hud og lemmer Bones
Summary
Immuncytokemiske identifikation af perifer sensorisk nerve fiber undertyper (og påvisning af protein udtryk deri) er nøglen til forståelsen af molekylære mekanismer, der ligger perifert sensation. Her har vi beskrive metoder til udarbejdelse af perifere / viscerale vævsprøver, såsom hud og lemmer knogler, for specifikke immunfarvning af perifere sensoriske nervefibre.
Abstract
Detection og primær behandling af fysiske, kemiske og termiske sensoriske stimuli af perifere sensoriske nervefibre er nøglen til sansning i dyr og mennesker. Disse perifere sensoriske nervefibre udtrykke et væld af receptorer og ion-kanal proteiner, som registrerer og iværksætte specifikke sensoriske stimuli. Der findes metoder til karakterisere de elektriske egenskaber af perifere sensoriske nervefibre innerverer huden, som også kan bruges til at identificere funktionelle udtryk for specifikke ion-kanal proteiner i disse fibre. Men lignende elektrofysiologiske metoder er ikke tilgængelige (og er også vanskeligt at udvikle) til påvisning af den funktionelle udtryk af receptorer og ion-kanal proteiner i perifere sensoriske nervefibre innerverer andre indre organer, herunder de mest udfordrende væv såsom knogle. Desuden kan sådanne elektrofysiologiske metoder ikke anvendes til at bestemme et udtryk for ikke-overgearet proteinS i perifere sensoriske nervefibre. Derfor immunfarvning af perifere / viscerale vævsprøver for sensoriske nerve Håndbold giver den bedst mulige måde til at bestemme et udtryk for specifikke proteiner af interesse i disse nervefibre. Hidtil har de fleste protein udtryk studier i sensoriske neuroner udnyttet immunfarvning procedurer i sensoriske ganglier, hvor oplysningerne er begrænset til ekspression af specifikke proteiner i cellen kroppen af bestemte typer eller delmængder af sensoriske neuroner. Her rapporterer vi detaljerede metoder / protokoller for udarbejdelsen af perifere / viscerale vævsprøver for immunfarvning af perifere sensoriske nervefibre. Vi har specielt detalje metoder til forberedelse af huden eller plantar punch biopsi og knogler (femur) afsnit fra mus til immunfarvning af perifere sensoriske nervefibre. Disse metoder er ikke kun nøglen til kvalitativ bestemmelse af protein udtryk i perifere sensoriske neuroner, men også give en kvantitativ analyse metode tilafgørende ændringer i protein udtryk niveauer i bestemte typer eller delmængder af sensoriske fibre, samt til bestemmelse af morfologiske og / eller anatomiske ændringer i antallet og tætheden af sensoriske fibre under forskellige patologiske tilstande. Desuden er disse metoder ikke begrænset til farvning af kun sensoriske nervefibre, men kan også bruges til farvning alle typer af nerve fibre i huden, knogler og andre viscerale væv.
Protocol
Discussion
Her har vi detaljeret de metoder til udarbejdelse af mus hud-og knoglevæv sektioner for immunfarvning og afsløring af perifere sensoriske nervefibre. Afsnittene fremstillet af plantar hudbiopsier indeholder både glatte og behårede hud, hvilket betyder, at protokollen kan bruges på enhver hudtype. Disse teknikker kan også anvendes til farvning af andre celletyper i disse væv (fx leukocytter, vaskulær endothelia, glatte muskelceller blandt andre). Disse metoder giver et glimrende kompromis mellem optimale ultrastr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Yuriy M. Usachev for hans hjælp i den indledende standardisering af konfokal mikroskopi / billeder af mus plantar punch biopsi immunfarvning, og Dr. Donna L. Hammond for hendes fortsatte hjælp og konstruktiv kritik i dette arbejde. Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra NINDS / NIH (NS069898), og en Idéudvikling Grant Award fra Department of Defense Prostate Cancer Research Program (DoD-PCRP-101096) til DPM
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue No. | Comment |
| 3mm Harris Micro-Punch | Material | Ted Pella | 15094 | |
| Perfusion pump | Material | VWR International | 23609-170 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Fisher Scientific | T353 | |
| Picric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 239801 | |
| OCT Embedding compound | Reagent | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray | Material | Control Company | 3118 | |
| Goat Serum | Reagent | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) | Material | RPI Corp. | 248270 (tray) 248270-A (lid) |
|
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Material | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) | Material | Ted Pella | 11859 | |
| Pro‐Long Gold Mounting medium | Reagent | Invitrogen | P36930 |
References
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).
- Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining. Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).
- Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7, 155-159 (1986).
- Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury. The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).
- Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline. Pain. 152, 308-313 (2011).
- Bloom, A. P. Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers. The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).
- Constantin, C. E. Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model. J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).
- Jankowski, M. P. Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling. The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).
- Jimenez-Andrade, J. M. Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain. J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).
- Persson, A. -. K. Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals. Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).
- Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin. Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).
- Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy. Pain. 140, 35-47 (2008).
