Immunocytochemische identificatie van perifere sensorische zenuwvezel subtypes (en de detectie van eiwit expressie daarin) zijn de sleutel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan perifere sensatie. Hier beschrijven we methoden voor de bereiding van perifere / viscerale weefselmonsters, zoals huid en ledematen botten, voor specifieke immunokleuring van perifere sensorische zenuwvezels.
Detectie en de primaire verwerking van fysische, chemische en thermische zintuiglijke prikkels door perifere sensorische zenuwvezels is de sleutel tot zintuiglijke waarneming bij dieren en mensen. Deze perifere sensorische zenuwvezels drukken een overvloed aan receptoren en ionkanaal eiwitten die op te sporen en aanzet geven tot specifieke zintuiglijke prikkels. Methoden beschikbaar om de elektrische eigenschappen van perifere sensorische zenuwvezels innerveren de huid, die ook kan worden gebruikt om de functionele expressie van specifieke ion kanaal eiwitten in deze vezels te identificeren karakteriseren. Echter, soortgelijke elektrofysiologische methoden zijn niet beschikbaar (en zijn ook moeilijk te ontwikkelen) voor de detectie van de functionele expressie van receptoren en ionkanaal eiwitten in de perifere sensorische zenuwvezels innerveren andere inwendige organen, inclusief de meest uitdagende weefsels, zoals bot. Bovendien kan een dergelijke elektrofysiologische methoden niet worden gebruikt om de expressie van niet-opgewonden eiwit te bepalens in de perifere sensorische zenuwvezels. Daarom, immunokleuring van perifere / viscerale weefselmonsters voor sensorische zenuw fivers biedt de best mogelijke manier om de expressie van specifieke eiwitten van belang in deze zenuwvezels te bepalen. Tot nu toe hebben de meeste van de eiwitexpressie studies in sensorische neuronen gebruikt immunokleuring procedures in sensorische ganglia, waar de informatie wordt beperkt tot de expressie van specifieke eiwitten in de cel lichaam van specifieke soorten of subsets van sensorische neuronen. Hier hebben we rapport gedetailleerde methoden / protocollen voor de bereiding van perifere / viscerale weefselmonsters voor immunokleuring van perifere sensorische zenuwvezels. We specifiek detail methoden voor de voorbereiding van de huid of plantaire punch biopsie en been (femur) secties van muizen voor immunokleuring van perifere sensorische zenuwvezels. Deze methoden zijn niet alleen essentieel voor de kwalitatieve bepaling van eiwitexpressie in de perifere sensorische neuronen, maar bieden ook een kwantitatieve bepalingsmethode voor dehet bepalen van veranderingen in eiwit expressie niveaus in bepaalde soorten of subsets van sensorische vezels, alsmede voor het bepalen van de morfologische en / of anatomische veranderingen in het aantal en de dichtheid van sensorische vezels tijdens verschillende pathologische toestanden. Verder zijn deze methoden niet beperkt tot de kleuring van enige zintuiglijke zenuwvezels, maar kan ook worden gebruikt voor het kleuren alle soorten zenuwvezels in de huid, botten en andere viscerale weefsel.
Hier hebben we gedetailleerd de methodes voor de voorbereiding van de huid van muizen en botweefsel secties voor immunokleuring en detectie van perifere sensorische zenuwvezels. De secties uit plantaire stansbiopsieën bevatten zowel kaal en behaarde huid, wat betekent dat het protocol dat gebruikt kan worden op elk huidtype. Deze technieken kunnen ook worden gebruikt om andere soorten cellen vlek in deze weefsels (bijv. leukocyten, vasculaire endotheel, glad spierweefsel onder andere). Deze methoden zorgen voor een uit…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken dr. M. Yuriy Usachev voor zijn hulp bij de eerste standaardisatie van confocale microscopie / beeldvorming van de muis plantaire punch biopsie immunokleuring, en Dr Donna L. Hammond voor haar voortdurende hulp en opbouwende kritiek in dit werk. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van het NINDS / NIH (NS069898), en een idee-ontwikkeling Grant Award van het ministerie van Defensie Prostaatkanker Research Program (DoD-PCRP-101096) om DPM
Material Name | Type | Company | Catalogue No. | Comment |
3mm Harris Micro-Punch | Material | Ted Pella | 15094 | |
Perfusion pump | Material | VWR International | 23609-170 | |
Paraformaldehyde | Reagent | Fisher Scientific | T353 | |
Picric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 239801 | |
OCT Embedding compound | Reagent | Tissue-Tek | 4583 | |
Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray | Material | Control Company | 3118 | |
Goat Serum | Reagent | Sigma-Aldrich | G9023 | |
Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) | Material | RPI Corp. | 248270 (tray) 248270-A (lid) |
|
ImmEdge hydrophobic barrier pen | Material | Vector Laboratories | H-4000 | |
Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) | Material | Ted Pella | 11859 | |
Pro‐Long Gold Mounting medium | Reagent | Invitrogen | P36930 |