말초 감각 신경 섬유 subtypes의 Immunocytochemical 식별 (과 그 안의 단백질의 표현 감지)는 주변 센세이션을 기본 분자 메커니즘을 이해하는 데 열쇠입니다. 여기 주변 감각 신경 섬유의 특정 immunostaining 위해 이러한 피부 및 사지 뼈와 같은 주변 기기 / 내장 조직 샘플,의 준비를위한 방법을 설명합니다.
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방법 논문
피부와 사지 본즈 Innervating 마우스 감각 신경 섬유의 조직 준비 및 Immunostaining
이 논문에서
요약
초록
말초 감각 신경 섬유에 의해 감지 및 물리적, 화학적 및 열 감각 자극의 기본 처리는 동물과 인간의 감각 지각의 열쇠입니다. 이러한 말초 감각 신경 섬유는 특정 감각 자극을 감지하고 시작 수용체 및 이온 채널 단백질의 과다를 표현한다. 방법은 다음과 섬유에서 특정 이온 채널 단백질의 기능 표현을 식별할 활용할 수 피부를 innervating 말초 감각 신경 섬유의 전기적 특성을 특징 사용할 수 있습니다. 그러나, 유사한 electrophysiological 방법을 사용할 수 없습니다 (또한 개발하기가 어렵습니다) 같은 뼈으로 가장 어려운 조직을 포함하여 다른 내장 기관을 innervating 말초 감각 신경 섬유에있는 수용체와 이온 채널 단백질의 기능 표현의 검출을위한. 또한, 그러한 electrophysiological 방법은 아닌 고르기 단백질의 표현을 결정하는 이용 수 없습니다말초 감각 신경 섬유에의. 따라서, 감각 신경 fivers을위한 주변 기기 / 내장 조직 샘플 immunostaining이 신경 섬유에 대한 관심의 특정 단백질의 표현을 결정하는 최선의 방법을 제공합니다. 지금까지, 감각 뉴런의 단백질 표현 연구의 대부분은 정보가 특정 유형이나 감각 신경의 일부의 세포 본문에 특정 단백질의 표현에 제한됩니다 감각 신경에 절차를 immunostaining 활용했습니다. 여기 주변 감각 신경 섬유의 immunostaining에 대한 주변 / 내장 조직 샘플의 준비에 대한 자세한 방법 / 프로토콜을보고합니다. 우리 피부 발바닥 펀치 생검 및 뼈 (대퇴골) 말초 감각 신경 섬유의 immunostaining에 대한 생쥐에서 섹션의 준비를 위해 특별히 세부 방법. 이러한 방법은 주변 감각 뉴런의 단백질 표현의 질적 결정에만 주요되지뿐만 아니라위한 양적 분석 방법을 제공감각 섬유의 특정 유형 또는 하위 집합의 단백질 발현 수준의 변화를 결정뿐만 아니라, 여러 병적인 상태 동안 감각 섬유의 수와 밀도의 형태학의 및 / 또는 해부 학적 변화를 결정하십시오. 또한, 이러한 방법은 감각 신경 섬유의 얼룩에 국한되지 않은, 또한 피부, 뼈 및 기타 내장 조직에있는 신경 섬유의 종류 얼룩 사용할 수 있습니다.
프로토콜
1. 동물 재관류
이 연구에서 수행한 모든 동물 절차는 아이오와 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회의 승인을, 그리고 연구에 동물 사용에 대한 NIH의 지침을 따르 있습니다.
- 재관류 전날 4 ° C. 1 인산 버퍼의 L (더블 소주 H 2 O, pH를 7.4에서 0.2 M PB) 및 저장을 준비 이것은 재관류 후 - 고정 공정에 사용됩니다.
- 30 초위한 유리 비커에 ddH 2 O의 전자 레인지 200 ML : 재관류 당일 (PFA, 산도 7.4) 0.1M PB에 4.0 %의 paraformaldehyde의 고정력있는 솔루션이 생쥐의 재관류에 대한 충분한 볼륨을 500 ML 준비 아니면 끓는 접근까지. 연기 후드 아래에 지속적인 교반과 함께 비커에 세분화된 paraformaldehyde 20 G (PFA)를 추가합니다. 드롭 현명하고 솔루션 나올 때까지 저어 5 N NaOH의 5 ML을 추가합니다. PFA가 완전히 해소되면, 실온 (RT)에 솔루션을 냉각. Slo지속적으로 교반하면서 wly 0.2 M PB 250 ML를 추가합니다. 점차적으로 약한 HCL 솔루션 (6 N 1 N 0.1 N)를 사용하여 7.4으로 산도를 조정합니다. 500 ML 얼음에 진정 최종....
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토론
여기 마우스 피부 immunostaining 및 주변 감각 신경 섬유의 검출을위한 뼈 조직 섹션의 준비를위한 방법을 상세있다. 발바닥 펀치 biopsies에서 생산 섹션 모두 glabrous와 털이 피부를 포함하는이 프로토콜은 모든 피부 타입에 사용할 수 수있다는 것을 의미합니다. 이 기술은 또한 (예 : leukocytes, 혈관 endothelia 다른 중에서 평활근)이 조직에서 다른 세포 유형을 얼룩이 고용 수 있습니다. 이러한 방법은 우수한 최적의 ultrastructural 보존 간의 타협 (글루 타 알데히드 고정에 의해 달성될 수 있지만 자주 epitopes 및 감소 immunostaining의 얼룩 품질 장애의 결과) 및 immunocytochemical detectability, 엄격한 방식으로 절차가 뒤에있다면 단계별로 제공합니다.
이러한 조직의 감각 신경 섬유의 탐지, 주변 neurite의 파생물의 규정에 대한 우리의 이해에 도움과 4 돋.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
그녀의 지속적인 도움을이 작품에서 건설적인 비판과 박사 도나 L. 해먼드, 우리는 공촛점 현미경 / 마우스 발바닥 펀치 생검 immunostaining의 이미징의 초기 표준화 그의 도움 박사 유리 M. Usachev 감사합니다. 이 작품은 NINDS / NIH (NS069898)에서 보조금 및 DPM에 국방 전립선 암 연구 프로그램의학과 (DOD - PCRP - 101096)에서 아이디어 개발 보조금 수상에 의해 투자되었다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| 재료 이름 | 유형 | 회사 | 카탈로그 번호 | 논평 |
| 3mm 해리스 마이크로 펀치 | 자료 | 테드 펠라 | 15,094 | |
| 재관류 펌프 | 자료 | VWR 인터내셔널 | 23609-170 | |
| Paraformaldehyde | 시약 | 피셔 과학 | T353 | |
| 피크르산 | 시약 | 시그마 - 올드 리치 | 239,801 | |
| OCT의 삽입 화합물 | 시약 | 조직 테크 | 4583 | |
| Cyto - 꼼짝마 극저온 에어로졸 스프레이 | 자료 | 제어 회사 | 3118 | |
| 염소 세럼 | 시약 | 시그마 - 올드 리치 | G9023 | |
| Immunostaining을위한 인큐베이션 트레이와 덮개 (대형) | 자료 | RPI 주식 회사 | 248270 (트레이) 248270 - A (뚜껑) | |
| ImmEdge 소수성 장벽 펜 | 자료 | 벡터 연구소 | H - 4000 | |
| 낙타 헤어 브러쉬 (# 1 두께) | 자료 | 테드 펠라 | 11,859 | |
| 프로 롱 골드 매체를 마운트 | 시약 | Invitrogen | P36930 |
참고문헌
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).
- Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes....
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재인쇄 및 허가
