1. Provberedning Växtmaterial skördas och fryses omedelbart. Frysta vegetabiliska material pulvriseras genom biandaren kvarn (eller mortel) och lagras i Falcon-rör eller Eppendorf-rör vid -80 ° C. 2. Extraktion för metabolitprofilering Alikvot frystes växtmaterial i en 2 ml Eppendorf-rör. Tillsätt 5 il extraktionsbuffert per milligram färsk vikt av frysta växtmaterial. Lägg till en metall (eller gilconia) boll och homogenisera av fryst pulver med mixern Mill i 2 min vid 25 ls -1. Centrifiigera 10 min vid 12.000 varv per minut. Överför supernatanten till Nanosep centrifugalfilter. Centrifugera 2 minuter vid 4.000 rpm. Överför supernatanten till nya Eppendorf-rör och lagra vid -20 ° C fram till användning. 3. Metabolitprofilering genom LC-MS Ställ in HPLC och kontrollera temperaturen i kolumn ugn och provbricka. Ställ in MS skick och kontrollera tillståndet av vakuum och värme kapillär. Utför m / z kalibrering av MS detektor. Överföring av 50 | il av extrakt till glasampull för LC-MS. Spruta in 5 il extrakt till LC-MS. 4. Dataanalys Konfigurera Xcalibur eller Metalign 4 och välj dataanalys som skall behandlas. Förbered en tabell över detekterade topparna i ditt intresse i enlighet med förening klass i tabell jag. Identifiera toppar genom sam-eluering av standardföreningar. Kommentera upptäcks toppar med MS 2-analys, litteratur undersökning metabolit databassökning (figur 2, 12,13). 5. Förutsägelse av metaboliska vägen Konstruera en möjlig väg med detekterade föreningar. Prediktion av vägen med topp kommentarer bör baseras på den kemiska strukturen hos upptäckt förenings genom att förutsäga länka enzymatiska funktioner på den metaboliska vägen 13. Strukturera biosyntetiska steg bör utföras med exakt toppen annotation. Men bestämningen av detaljerad kemisk struktur, t ex socker-enhet, är inte nödvändigt i detta steg, eftersom förutsägelse av sockerenheten och aducerade läge är mycket svårt att identifiera med MS-analys. Fastställande av socker typ såsom hexoside och pentoside kommer att identifieras genom enzymatisk analys av socker donator i sista steget i projektet. Mestadels bygga om förutsägelse av vägen bör utföras så liten molekyl är mellanprodukt med större molekylen utom i de vissa fall, såsom uttorkning reaktion. Listan av atomärt molekylvikt, t ex 16 m / z för skillnaden mellan-H och-OH-gruppen (oxidation), 14 m / z (kolatomen) för skillnaden mellan-OH och-OMe (metylering) och 162 m / z ( MW-H2O) för hexos (glykosylering), är användbar för att förutsäga. Bestämning avmodifiering typ med korrelationsanalys av vävnader särdrag bidrar förutsägelse av metaboliska väg. Databas över allmänna metabolismväg som Kegg databas ( http://www.genome.jp/kegg/ ) och PlantCyc ( http://plantcyc.org/~~V ) är mycket effektiv för att förutsäga metabolismen för ditt intresse. 6. Beredning av Gene Lista med Arabidopsis ortologa Gene ID Nedladdningslista gen ID från genomisk databas. Lägg Arabidopsis gen ID ortologa gen, vid ditt mål anläggningen inte Arabidopsis. Förbered en lista av gener i din väg av intresse. Notering av Arabidopsis pathway data och gen uppgifter familj finns i TAir webbplats ( http://www.arabidopsis.org/~~V ). Om du upprättat en lista över Arabidopsis ortologa gener, kan du kombi sedanne dem. 7. Samuttryckt Gene Analysis Testa att använda upprättade förteckningen genen ID för att söka bästa databasen för din väg genom att kontrollera korrelationen med välkända genpar i din väg av intresse (Tabell II). Om samexpression databas eller genuttryck databasen finns inte i anläggningen för ditt intresse, bör Arabidopsis samuttryck databas användas med en lista över Arabidopsis ortologa gener. I fall av korn, kan ris, poppel, vete, Medicago och sojaböna, samuttryck analys av växtarter användas (tabell II). Konstruera ramen för din målgrupp samuttryck nätverk baserat på anslutningarna av de väl kända gener i din väg av intresse. Lägg korrelerade kandidatgener (R <0,4 ~ 0,90, inom ungefärliga värdet koefficient värde mellan anslutningarna av de väl kända gener i din väg av intresse) och kontrollera deras gen anteckning i predicted familjer till anslutningar detta nätverk för att hitta bästa kandidatgener (Figur 3). Tröskelvärde på koefficient värde bör samordnas enligt nätverksstruktur och densitet korrelerade gener. Gör lista över gener som du har möjlighet att begränsa som specialiserat till ditt mål väg. Kontrollera genuttryck av organ särdrag och svar stress i ditt kandidatgener. 8. Integration av all information att förutse nya vägar Lägg väl karakteriserade gener som har använts för sökning av samuttryck analys förutspådde metaboliseringsvägen. Kontrollera okarakteriserade delar i denna väg, till exempel okaraktäriserat enzymatiska steg, proteiner transporter och transkriptionsfaktorer. Förutse mest lämpliga gen anteckning för dessa okarakteriserade saknade steg. Kombinera resultaten av metaboliten profilering och kandidatgener för i silico GEne uttryck baserat på den förutsagda banan. Ordna kandidatgener för den beräknade vägen beroende på genfunktion, till exempel acetyltransferas för acetylerade metabolit, glykosyltransferaset för glykosid, P450 för oxiderade förening. Fylogenetiskt träd analys av aminosyrasekvenser är användbar för vissa breda genfamiljen såsom P450 och glykosyltransferas. Kontrollera konsistens vävnad särdrag eller svar spänning mellan metabolit ackumuleras och genuttryck nivå kandidatgener. Kontrollera anslutningarna till andra metabolism för att ge substrat och stress känsliga gener. 9. Experiment för Gene identifiering med Bio-resurser Kontrollera tillgången bioresurser för underlättande av experiment för kandidaten gen identifiering. Gör ett experiment för att identifiera geners funktion med hjälp bioresurser, såsom KO mutant bibliotek och full cDNA bibliotek. Than experiment för funktionell identifiering av gener med beredning av överuttryck växter och mutanter knockout, enzymatiska assay och promotor bindningsanalysen måste utföras för bästa kandidatgener i din förutsägelse. Rekombinant protein analys för karakterisering av protein egenskaper och beredning av överuttryck växter bättre skall utföras efter bekräftelse av metabolit profil med KO mutant eftersom det tar betydligt längre tid att förbereda rekombinant protein och gen kloning för transformation. 10. Representativa resultat Förfarandet för integrerad analys som beskrivs i detta protokoll har många möjligheter, beroende på viss experimentell syfte och val av biologiska och analytiska kombinationer. Valet av förfaranden och experimentell design bör göras på rätt sätt på grund av ditt mål väg, föreningar och växtarter. Den integrationsstrategi som beskrivs i detta protokoll är FOC används på notering av växt-genfunktion och upptäckten av nya genfunktioner med en effektiv användning av flera bio-och data-resurs. Förväntade resultatet är lovade att förse med det enda fallet av avgörande förutsägelse. Detta faktum tyder på att om tillräckligt många bevis inte kan ges av en kombination profiler bör försök inte startas. Av denna anledning i några fall kan ytterligare preliminära experiment som riktade profilering av genuttryck av RT-PCR, stödjer din förutsägelse av genfunktion. Noggrannhet och korrekthet förutsägelse korrelerar högre beroende på kvalitativa skillnaden och antal variation av kombination. Dessutom kan goda kandidater och giltiga resultat kommer endast korrekt förutsägelse av vägar. Peak anteckning bör ledas av en kombination av flera metoder, till exempel litteraturstudie, referens växtextrakt, MS N analys, orgel specificitet och mutant analys 13. 1 "src =" / files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg "/> Figur 1. Översikt över den experimentella flödet av genen annotation via kombinerade tillvägagångssättet. I vissa fall projekt börjar med upptäckten av en ny topp som upptäcks i särskilda villkor eller vävnader, och önskan att förstå sin roll i sin metabolism. I andra fall syftet med projektet är genidentifiering eller upptäckt av centrala faktorer som transkriptionsfaktorer. Design av försöket bör hyvlas med en datamängd som visar tydliga skillnader av metabolit nivåer i din målgrupp väg, med hjälp av ett brett spektrum av vävnadsprover från olika organ, och för differentiell odlade växter eller växter utsätts för påfrestningar, och utsätta materialet till metabolit profilering. Mutant och transgena växter samt QTL hysande avelsmaterial representerar också lämpligt genetiskt material för dessa studier. Förutsägelse av ny väg måste utföras noggrant med korrekttopp notering och kombination strategi med olika typer av metabolotype som organ värdepapper och svar belastning enligt genuttryck uppgifter på din väg av intresse. I det sista steget, bör metabolit och utskrift profilering utföras som så småningom kommer i kombination med in silico analys av webb-resurser och in vitro karaktärisering av genuttryck via heterologt uttryck, att leda till en bekräftelse av genen kandidaten och klarläggande av dess funktion och position i en metabolisk väg. Förkortningar: QTL och quantitative trait loci. Figur 2. Arbetet flöde av kombinatoriska metod för topp notering. En förfarande för peak identifikation och anteckningar av standarden föreningen, jämförelse av vild typ och slå ut mutanter, multi-dimensionell masspektrometri av målet toppen hänvisning till masspektra av ren compounds från databaserna 12. Förkortningar: DB, en databas, KO, knock-out, 1-D, en-dimensionella, 2-D, tvådimensionella, NMR, kärnmagnetisk resonans, IR, infraröd, MS n, massa-massa spectrometries. Figur 3. Exempel samreglering nätverk analys av antocyanin vägen. Samexpression utfördes med hjälp av PRIME ( http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index ) baserat på de uppgifter som i ATTEDII version 3 8,2 med Pajek programmet ( http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/ ). Positiva korrelationer (R <0,5) används för att göra nätverksanslutningar. Röd nod: tolv antocyaninfärgning enzymatiska gener (At5g13930, CHS och tt4 och chalkonsyntas; At3g55120, CHI, TT5, chalkon isomerisera, At3g51240, F3H, TT6, flavanon 3-hydroxylas, At5g07990, F3'H, TT7, flavonoid 3'-hydroxylas, At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, flavonoid 3 – O-glukosyltransferas, At5g17220, AtGSTF12, TT19 , At5g42800, DFR, TT3, dihydroflavonol reduktas, At4g22880, ANS / LDOX, TT18, antocyanidin Synthese, At4g14090, A5GT, antocyanin 5 – O-glukosyltransferas, At5g54060, A3G2 "XT, förmodade antocyanin 3 – O-glukosid 2" – O – xylosyltransferas, At3g29590, A5GMaT, antocyanin 5 – O-glukosid 6'' '- O-malonyltransferas, At1g03940, A3GCouT, antocyanin 3 – O-glukosid 6 "- O – p-coumaroyltransferase) och två transkriptionsfaktorer för antocyaninfärgning produktion (At1g56650, PAP1, At1g66390, PAP2) användes för att söka kandidatgener kandidatgener hittades av en "korsning uppsättningar" Sök med ett tröskelvärde med en koefficient av r <./ Em >> 0,50 ifrågasattes av korsningen av uppsättningar av alla tillfrågade gener (fjorton antocyaninfärgning biosyntetiska gener). En samexpression nätverket, inklusive korrelerade kandidatgener (68 gener) och efterfrågade gener (14 gener), re-konstruerad av ett "sammankoppling av apparater" Sök med r> 0,50 med PRIME databasen. De utgående filer som är formaterade med ett ". NET" filen från PRIME databasen och nätverk drogs med Pajek programvara. Blå nod indikerar kandidatgener som korrelerade med antocyaninfärgning gener. arter Större sekundär metabolit Arabidopsis thaliana Glukosinolathalt, flavonol, antocyanin, sinapoyl derivat Populus trichocarpa Flavonol, antocyanin, salicylat derivat Vitis vinifera Flavonol, antocyanin, tannin, stilben Solanum lycopersicum Flavonol, antocyanin, glycoalkaloid, chrologenate närstående, Nicotiana tabacum Flavonol, antocyanin, nicotianamide, chrologenate relaterade, acylsugar Oryza sativa Glycoflavone, antocyanin, sterolderivat Zea kan Glycoflavone, antocyanin, bensoxazinon, sterolderivat Medicago truncatula Isoflavon, antocyanin, saponin, Lotus japonica Isoflavon, flavonol, antocyanin, saponin, Tabell I. Stora sekundära metaboliter i arter modell växter. Samuttryck databasen Adress Växt över specer COP http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V PlaNet http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/ Växtarter ATEED-II http://atted.jp/ BAR http://142.150.214.117/welcome.htm COP http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop GeneCAT http://genecat.mpg.de/ Arabidopsis AGERA http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser AthCoR@CSB.DB http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html CressExpress http://cressexpress.org/~~V PRIME http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index Oryza sativa RiceArrayNet http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V Ris Array Databas http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml Tabell II. Finns genuttryck databas för in silico samuttryck analys.