세포의 인구의 세포주기의 위치를 결정, 또는 신호가 증식에 미치는 영향에 대해 이해하고, 쉽게이 프로토콜을 사용하여 유동세포계측법에 의해 측정할 수 있습니다. 우리는 세포를 얼룩 및 세포주기 자신의 지위를 quantifying하는 간단한 실험 방법을보고합니다.
세포 증식의 조절은 다세포 생물의 개발 기간 동안 조직 morphogenesis 데있어서 중심이되는 부분입니다. 또한, 세포 증식의 조절의 손실이 암 같은 질병의 병리를 underlies. 같은 세포 증식을 조사하고 세포주기의 각 단계에서 세포의 비율을 quantitate 수 있도록 큰 필요가있다. 그것은 indistinguishably 큰 인구 내에서 DNA를 복제 아르 세포를 식별하는 데 필수적인 중요성 또한이다. 분아 따위에 의해 번식하는 세포의 결정은 DNA 합성을 시작하고 세포주기의 나머지 부분을 통해 진행하기 전에 바로 G1 단계에서 만들어진 것이므로,이 단계에서 DNA 합성의 감지 세포 배양 성장 조절의 상태를 모호하지 않은 결정을 허용 실험.
세포에서 DNA의 내용은 쉽게 propidium 요오드화물의, 형광 DNA intercalating 염색 물들일 세포의 유동세포계측법에 의해 quantitated 수 있습니다.마찬가지로, 적극적인 DNA 합성은 세포를 수확하고, 산성 불용성 분획에 방사능의 결합을 측정, 방사성 thymidine의 면전에서 culturing 세포에 의해 quantitated 수 있습니다. 우리는 세포주기 분석 상당한 전문 지식을 가지고 다른 접근 방식을 권장합니다. 우리는 bromodeoxyuridine / fluorodeoxyuridine (BrdU로 간단히 축약) 최근 DNA 합성 이러한 thymine analogs의 결합을 감지 염색법을 사용하여 세포 증식을 조사합니다. 라벨 및 유동세포계측법 1 propidium 요오드화물 및 분석하여 총 DNA의 얼룩과 함께 BrdU와 세포를 얼룩하면 세포주기의 다양한 단계에서 세포의 가장 정확한 측정을 제공합니다. 그것이 propidium 요오드화물의 전체 DNA의 내용과 BrdU의 항체 기반의 얼룩을 통해 적극적인 DNA 합성의 검출을 결합하기 때문에 우리가 선호하는 방법입니다. 이것은 초기 단계에서 S G1에서 세포의 명확한 분리, 또는 늦은 S G2 / M.의 위상을 허용또한,이 방식이 서로 다른 세포주기의 단계를 통해 진행의 규정에 다양한 세포 자극 및 pharmacologic 대리인의 효과를 조사하기 위해 이용하실 수 있습니다.
이 보고서에서 우리는 교양 세포뿐만 아니라 유동세포계측법하여 분석을 라벨과 얼룩에 대한 방법을 설명합니다. 우리는 또한이 방법은 성장 등 TGF – β1으로 크린 시토킨에서 억제 신호와 같은 cyclin 의존 키나제 억제제, p27KIP1로 proliferative 억제제의 효과를 측정하는 데 사용할 수있는 방법을 실험 예제를 포함합니다. 우리는 또한 큰 문화의 5 이내 세포의 하위 인구의 세포주기의 위치 분석을 허용 다른 프로토콜을 포함합니다. 이 경우, 우리는 크게 같은 문화에 untransfected 세포 열세에도 retinoblastoma 유전자와 transfected 세포의 세포주기 정지를 감지하는 방법을 보여줍니다. 이 예제는 DNA의 얼룩 많은 방법을 설명하고유동세포계측법은 활용 및 포유 동물 세포주기 조절의 근본적인 문제를 조사하기 위해 적용할 수 있습니다.
우리의 경험에서이 기술을 성공 몇 가지 주요 컨트롤과 실험 조건에 따라 달라집니다. 하나는이 실험에 사용하기 위해 비동기 proliferating 컨트롤을 구축합니다. 이 컨트롤은 세 중요한 목적을 수행합니다. 첫째, 모든 실험 샘플에 사용되는 문화 조건이 치료의 부재로 지속적인 확산을 지원하기 위해 충분한 것을 보장합니다. 이 예제에서는 또한 존재하는 경우 BrdU 또는 CD20 양성 세포가 발견 될 수 있도록하기 위해 얼룩 방법론에 대한 긍정적인 컨트롤의 용도를 제공합니다. 마지막으로,이 예제는 흐름 cytometer를 보정하는 데 사용됩니다. 이 컨트롤 예제는 각각 200 400 2N와 4N 세포를 감지하는 propidium 요오드화물 얼룩 강도를 조정하는 데 사용할 수 있습니다. 부정과 긍정적인 신호로 그림 1A와 2A에 표시된 중심되도록 또한, BrdU 또는 CD20의 검출 감도를 조정할 수 있습니다. 모든 샘플은 PI – R의 세포와 비슷한 농도있을 때이후 샘플이 실행되면서 Nase 솔루션은 다음 cytometer에 몇 가지 조정이 필요합니다. 이것은 그림에 표시된 이유로 중요합니다. 강력한 G1 축적은 본질적으로 G2 / M. 것으로 잘못 이해할 수있는 하나의 G1 피크를 생성 4B와 5B
대표 실험은 또한 다른 중요한 포인트를 확인하십시오. 첫째, 그들은 BrdU의 이해와 라벨이 세포 유형 간의 다를 수있다는 것을 보여준다. 이런 이유로 그것은 경험적으로 맥박과 적절하게 S – 단계에서 세포를 감지하는 데 필요한 얼룩 조건의 길이를 결정하는 것이 중요합니다. 일반적으로 적은 24 시간의 문화에서 더블 휴대 타입은 시간에 BrdU로 표시하실 수 있습니다. 느린 성장 세포 유형 항체 얼룩 조건과 기간에 더 이상 펄스 및 변경을 요구할 수 있습니다. 그들이 네 번 한에 대한 항체의 두 표준 농도로 4 시간 스테인드 위해 BrdU와 라벨이 붙지만 같은 MCF10A 전지는이 점에서 훌륭한 예제입니다. 수사이것이 잘못 S – 상 인구 G2 / M 세포의 포함으로 이어질 수도 매우 느리게 성장하는 세포와 라벨링 BrdU 6 시간을 초과하지 않도록주의하여야한다. 둘째, TGF – β1의 기능과 p27KIP1 표현의 효과를 비교에서, 그것은 TGF – β1 신호는 G1의 체포를 유도하면서 p27은 G1 또는 G2 / M 단계 중 하나의 축적을 일으킬 수 분명하다. 이러한 3 H – Thymidine의 설립 및 섬광 계수로 확산을 감지 전통 수단이 가능성을 구별할 수 없습니다.
우리가 다른 프로토콜에서 우리는 큰 untransfected 인구 세포의 하위 인구의 감지를 보여줍니다. 경험적으로 transfected 세포를 검출을위한 가장 적합한 기자를 결정하는 것이 중요합니다. 우리의 경험의 일부 세포 유형의 표현 세포 표면 중 하나는 제대로 마커, 또는 플라즈마 막 제대로 트래픽을, transfected 세포를 감지하지 못할 그 결과 수 없습니다. Likewise, 모든 세포가 GFP의 멤브레인 바운드 양식을 용납하지 않습니다. 가장 적합한 기자의 선택은 transfection의 기자의 효율성뿐만 아니라 untransfected 컨트롤에 비해 표현의 상대적 강도를 평가하여하여야한다. 이상적으로, 이러한 분자의 heterologous 표현이 잘 용납이이 마커는 세포주기 분포에 영향 거의있다는 암시이다 것입니다.
유동세포계측법 접근 방식의 이러한 유형 중 하나는 제한 그들은 서로 비교하여 세포주기의 단계의 상대 abundances을 설정할 수있는 것입니다. 그냥 S – 단계에 상대적으로 이러한 단계를 통해 진행을 느리게하는 경우 그림 3에서 p27의 표현이 진정으로 G1 및 G2 / M에 체포를 유도하거나 경우에 이런 이유로 그것은 모호한 것입니다. 이러한 가능성은 mitotic와 같은 nocodazole 같은 억제제 또는 aphidicolin 같은 G1 / S 억제제와 세포의 병렬 샘플을 처리하여 더 이상 조사 수 있습니다. 이러한 약물은 마님을 만들므로NT의 M – 단계에서 체포 또는 각각 S – 단계 초기는 천천히 proliferating 세포는 약물 유도 체포 지점에 축적됩니다. 제어 세포가 M – 단계 13 축적 반면 때문에 PRB 표현의 G1에 체포 예를 들어 세포는 nocodazole 치료에도 불구하고 G1에 남아있는 것이다.
합쳐 놓으면,이 실험 방법은 포유 동물 세포주기 연구 질문의 다양한 적용할 수있는 유연한 방법을 제공합니다. 그들은 쉽게 세포주기 진행의 변경을 감지하고 제어와 비교하여 차이점을 계량하실 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 보건 연구 (CIHR)와 자신의 실험실에서 세포주기의 연구 자금에 대한 캐나다 암 협회의 캐나다 연구소 감사하고 싶습니다. MJC은 CIHR에서 MD / 박사 교제를받는 것입니다. MJC와 석사는 CaRTT 훈련 프로그램의 회원입니다.
Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
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Cell Proliferation Labeling reagent | GE Amersham | RPN201 | |
Anti-BrdU Antibodies | BD Biosciences | 347580 | |
Anti-Mouse FITC conjugated Antibodies | Vector Labs | FI-2000 | |
Cell Strain Filters | BD Falcon | 352235 | |
Anti-CD20 Antibodies | BD Biosciences | 347673 | |
Multi Cycle Software | Phoenix Flow Systems | N/A |