Determinar la posición del ciclo celular de una población de células, o la comprensión de cómo afectan a la proliferación de señales, puede ser fácilmente medido por citometría de flujo utilizando este protocolo. Se presenta un enfoque simple experimental para la tinción de células y la cuantificación de su posición en el ciclo celular.
La regulación de la proliferación celular es esencial para la morfogénesis de tejidos durante el desarrollo de organismos multicelulares. Además, la pérdida de control de la proliferación celular subyace a la patología de enfermedades como el cáncer. Como tal, hay una gran necesidad de ser capaces de investigar la proliferación celular y cuantificar la proporción de células en cada fase del ciclo celular. También es de vital importancia para identificar indistintamente las células que se replican su ADN dentro de una población más grande. Desde la decisión de una célula a proliferar se realiza en la fase G1 inmediatamente antes de iniciar la síntesis de ADN y el avance en el resto del ciclo celular, la detección de la síntesis de ADN en esta etapa permite una determinación inequívoca de la situación de la regulación del crecimiento en cultivo celular experimentos.
Contenido de ADN en las células pueden ser fácilmente cuantificado por citometría de flujo de células teñidas con yoduro de propidio, un tinte de ADN intercalantes fluorescentes.Del mismo modo, la síntesis de ADN activo puede ser cuantificada por el cultivo de células en presencia de la timidina radiactiva, de recoger las células, y midiendo la incorporación de radiactividad en una fracción insoluble en ácido. Tenemos una experiencia considerable con el análisis del ciclo celular y recomendar un enfoque diferente. Se investiga la proliferación celular utilizando bromodesoxiuridina / fluorodesoxiuridina (abreviado simplemente como BrdU) tinción que detecta la incorporación de estos análogos de la timina en el ADN sintetizado recientemente. El etiquetado y la tinción de las células con BrdU, junto con la tinción de ADN total de yoduro de propidio y análisis por citometría de flujo 1 ofrece la medida más precisa de las células en las distintas fases del ciclo celular. Es nuestro método preferido, ya que combina la detección de la síntesis de ADN activa, mediante la tinción de BrdU basados en anticuerpos, con un contenido total de ADN de yoduro de propidio. Esto permite la separación clara de las células en el G1 de primera fase S, o S a finales de la fase G2 / M.Además, este enfoque puede ser utilizado para investigar los efectos de muchos estímulos diferentes de células y agentes farmacológicos en la regulación de la progresión a través de estas diferentes fases del ciclo celular.
En este informe se describen los métodos para el etiquetado y la tinción de las células en cultivo, así como su análisis por citometría de flujo. También se incluyen ejemplos experimentales de cómo este método puede ser utilizado para medir los efectos de las señales que inhiben el crecimiento de las citocinas como el TGF-β1, y los inhibidores de proliferación, como el inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina, p27Kip1. También se incluye un protocolo alternativo que permita el análisis de la posición del ciclo celular en una subpoblación de células dentro de una cultura más amplia 5. En este caso, se demuestra cómo detectar una detención del ciclo celular en células transfectadas con el gen del retinoblastoma, aun cuando en gran medida superados en número por las células no transfectadas en la misma cultura. Estos ejemplos ilustran las muchas formas en que la tinción de ADN ycitometría de flujo pueden ser utilizados y adaptados para investigar cuestiones fundamentales de control de ciclo celular de mamífero.
En nuestra experiencia, el éxito de estas técnicas depende de unos pocos controles clave y las condiciones experimentales. Uno de ellos es el establecimiento de un control de la proliferación de manera asíncrona para su uso en estos experimentos. Este control tiene tres propósitos importantes. En primer lugar, asegura que las condiciones de cultivo utilizado para todas las muestras experimentales son suficientes para apoyar la proliferación continua de la ausencia de tratamiento. Este ejemplo también sirve el propósito de un control positivo de la metodología de tinción para asegurarse de que BrdU o células CD20 positivas se pueden detectar cuando están presentes. Por último, la muestra se utiliza para calibrar el citómetro de flujo. Esta muestra de control se puede utilizar para ajustar la intensidad de tinción con yoduro de propidio para detectar células 2N y 4N a 200 y 400, respectivamente. Además, la sensibilidad de detección de BrdU o CD20 se puede ajustar para que las señales positivas y negativas se centran, como se muestra en las figuras 1A y 2A. Cuando todas las muestras tienen una concentración similar de células en el PI-RNase solución, entonces algunos ajustes en el citómetro se necesitan muestras posteriores se ejecutan. Esto es importante por razones de la figura. 4B y 5B, donde la acumulación de G1 fuerte crea esencialmente un pico G1 único que podría ser mal interpretada como G2 / M.
Los experimentos representante también hacen otros puntos importantes. En primer lugar, demuestran que la captación de BrdU y el etiquetado pueden variar entre los tipos de células. Por esta razón es importante para determinar empíricamente la duración del pulso y de las condiciones de coloración necesarias para detectar adecuadamente las células en fase-S. En general, los tipos de células que hacen las veces de la cultura en 24 horas o menos se pueden etiquetar con BrdU en una hora. De crecimiento más lento tipos de células pueden requerir más tiempo las legumbres y las alteraciones a las condiciones de la tinción de anticuerpos y la duración. MCF10A células son un excelente ejemplo en este sentido, ya que fueron marcadas con BrdU durante cuatro horas y se tiñeron con el doble de la concentración normal de anticuerpos en cuatro veces más. Los investigadoresdebe tener cuidado de no exceder de 6 horas de BrdU a pesar de las células de crecimiento muy lento, ya que erróneamente puede conducir a la inclusión de G2 / M en la población de células en fase S. En segundo lugar, en la comparación de los efectos de p27Kip1 expresión con los de TGF-β1, está claro que p27 puede inducir a una acumulación en cualquiera de las fases G1 y G2 / M, mientras que el TGF-β1 señalización induce una detención en G1. Los medios tradicionales de detección de la proliferación como la 3 H-timidina y recuento de centelleo son incapaces de distinguir estas posibilidades.
En nuestro protocolo alternativo que demuestran la detección de una subpoblación de células en una población mayor no transfectadas. Es importante determinar empíricamente el reportero más apropiado para la detección de las células transfectadas. En nuestra experiencia, algunos tipos de células de la superficie celular o bien expresan marcadores de mal, o no puede apropiadamente el tráfico a la membrana plasmática, resultando en una incapacidad para detectar las células transfectadas. Likewise no todas las células tolerar la forma unida a la membrana de las buenas prácticas agrarias. La selección de la reportera más apropiado debe ser hecha por la evaluación de la eficacia de transfección de la periodista, así como la intensidad relativa de expresión en comparación con los controles no transfectadas. Lo ideal es la expresión heteróloga de estas moléculas es bien tolerado y esto sugiere que los marcadores tienen poco o ningún efecto sobre la distribución del ciclo celular.
Una limitación de este tipo de métodos de citometría de flujo es que sólo son capaces de establecer las abundancias relativas de las fases del ciclo celular en comparación con los otros. Por esta razón, es ambigua si la expresión de p27 en la Figura 3 realmente induce un arresto en G1 y G2 / M, o si sólo se disminuye la progresión a través de estas fases en relación con la fase S. Estas posibilidades pueden ser investigados aún más por el tratamiento de una muestra paralela de células con un inhibidor de la mitosis, como nocodazole, o G1 / S, como inhibidor de la aphidicolin. Ya que estos fármacos crear una dominaciónnt arresto en la fase M o principios de la fase S, respectivamente, las células proliferan lentamente se acumula en el punto de arresto por drogas inducida. Por ejemplo, células detenidas en G1, debido a la expresión pRb se mantendrá en el G1 a pesar del tratamiento, mientras que nocodazole control de las células se acumulan en la fase-M 13.
En conjunto, estos enfoques experimentales ofrecen una metodología flexible que puede aplicarse a una amplia gama de preguntas de investigación de células de mamíferos ciclo. Ellos fácilmente pueden detectar alteraciones en la progresión del ciclo celular y cuantificar las diferencias en comparación con los controles.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) y la Sociedad Canadiense del Cáncer para financiar la investigación del ciclo celular en el laboratorio. MJC es un beneficiario de una beca de MD / PhD de la CIHR. MJC y MA son miembros del programa de formación CaRTT.
Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
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Cell Proliferation Labeling reagent | GE Amersham | RPN201 | |
Anti-BrdU Antibodies | BD Biosciences | 347580 | |
Anti-Mouse FITC conjugated Antibodies | Vector Labs | FI-2000 | |
Cell Strain Filters | BD Falcon | 352235 | |
Anti-CD20 Antibodies | BD Biosciences | 347673 | |
Multi Cycle Software | Phoenix Flow Systems | N/A |