含量测定的LRRK2的激酶活性在体外</em

Summary

富亮氨酸重复激酶2是一个大型的多域激酶，基因突变，其中最常见的帕金森氏病的遗传原因。这种蛋白激酶活性分析已被证明是在了解这种蛋白质的生物学和功能障碍的重要工具。在本文中，<em>在体外</em>化验的LRRK2激酶活性和描述及其突变体的选择，提供了一个实验系统研究假定基板和潜在的功能障碍疾病的LRRK2磷酸化。

Abstract

富亮氨酸重 ​​复激酶2（LRRK2）是一个2527氨基酸的蛋白质ROCO家族的成员，拥有一个复杂的，多域结构，包括一个GTP酶域（称为中华民国，复杂的蛋白质RAS）和一个激酶^结构域1。 LRRK2突变LRRK2引起帕金森氏病（PD）在2004年发现导致体积庞大的研究重点，并到其正常功能的蛋白质如何去歪在疾病^状态 2,3 。初步调查到的LRRK2的功能集中^在 4-6酶活性。清晰的画面，虽然尚未出现在这些一致的改动由于突变，从一批批数据突出了LRRK2激酶活性在与突变^7,8的细胞死亡的重要性。最近的出版物报道针对LRRK2激酶活性的抑制剂，提供了重要的^实验工具9-11。鉴于这些数据，LRRK2的酶学性质，我们提供的这种蛋白质的生物学的一个重要窗口，虽然无论是帕金森氏症的潜在的药物靶标是公开辩论。

一些不同的方法已被用于检测激酶活性的LRRK2。最初，检测进行使用表位标记的蛋白在哺乳动物细胞中过度表达，免疫沉淀，进行检测，使用这种蛋白质固定在琼脂糖^珠 4,5,7 。随后，纯化的重组解决方案LRRK2片段也被用来例如，GST标签的片段纯化昆虫细胞中含有残留LRRK2 ¹² 970 2527。近日，丹尼尔斯等人的隔离解决方案，从人类胚胎肾细胞全长LRRK2，但这种蛋白质是没有广泛使用的¹³个。相比之下，GST融合截断LRRK2形式是商业availablE（Invitrogen公司，详见表1），并提供了一​​个方便的工具表明LRRK2激酶活性检测。 LRRK2激酶活性的几种不同的输出报告。根据Moesin 558苏氨酸的磷酸化，被称为LRRKtide – – LRRK2髓鞘碱性蛋白（MBP）作为一种通用的激酶底物和一个人工基质磷酸化，磷酸化的自身磷酸化都被用来作为有一系列公认的生理底物包括α-突触核蛋白，Moesin和4 EBP的^14-17。这些蛋白质作为LRRK2基板的状态仍不清楚，下文所述的协议，将重点放在作为一种通用的基板使用MBP的检测LRRK2激酶活性，针对潜在的承印物范围，并指出这一制度的效用。

Protocol

安全 下面所描述的协议利用放射性32磷 ATP标记的γ磷酸遵循的LRRK2的激酶活性。它是基于在我们的实验室中使用的标准协议，并在如运行凝胶过程中的许多步骤， 免疫印迹等等的材料和精密的 ​​条件，应作为设备和协议的指导用于这些过程的变化，从实验室到实验室。含有同位素发射电离辐射可能危害人体健康和严格的许可证制度和法规的机构和国家一级控制其使用。在本议定书进行了实验在开源使用辐射伦敦大学学院的培训，并在学院提供的安全服务的指导方针的良好实验室操作规范（指引AVAilable http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf ）。适当的培训和监管部门的批准之前，不应尝试使用开源的辐射。监管机构，负责开放源码辐射实验室研究因国家而异。这方面的例子是：在英国的健康与安全执行局（ http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm ）在美国，核管理委员会（ http:// www.nrc.gov /材料/苗丰强/ REGS指南- comm.html ），加拿大核安全委员会（ http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ），在加拿大和德国DAS Bundesamt献给Strahlenschutz（ HTTP ：/ / www.bfs.de / DE / BFS ）。在其他国家的用户，应确认与辐射安全主任的地方性法规，规章和发牌当局。人们已经注意到，在文本本议定书有关的安全防范措施，突出具有放射性的三叶符号（ ）。 1。准备激酶反应所有反应混合物的准备1.5毫升样品管中含有一个O形环，以防止放射性扩散的螺丝帽。 在冰上解冻蛋白 – 野生型，D1994A，LRRK2 G2019S。 弥补冰 – 0.5μg/μlMBP的LRRK2，10NM，5ul的10X激酶缓冲，使水以50μL的反应。 2。运行检测利用32个P ATP的所有步骤应取p花边在指定的辐射区域。 合适的个人防护装备应戴 – 根据本实验室的标准作业程序，其中包括实验室外套，双层手套和护目镜。 样品含有32个P ATP应该屏蔽6毫米的有机玻璃屏幕，以尽量减少暴露用户。 在适用情况下，个人监测设备应使用 – 在伦敦大学学院，任何认证的开放源码的辐射用户必须有一个电影的徽章监控在实验过程中的辐射暴露。 应该评估所有实验表面放射性污染之前和之后使用使用的基GER计数器。 所有可能被污染的消耗品应处置放射性废物处置的机构准则的严格遵守。 开始检测之前，到30 ° C和100 ° C分别设置加热块取出-20冰箱（请注意，储存条件，从32个P ATP可能会有所不同供应商或使用的radionucleotides 类型而定 ）的32个P ATP。 扫描以外的容器，使用前，有机玻璃屏幕背后解冻。 在冰上的反应， 新增32个 P ATP加入1μl，随着冷ATP 10微米。 用吸管拌匀。 脉冲离心机把液体的试管底部，减少污染的危险。 零时间点取出15μl等份ð终止此外，5μL4X SDS样品缓冲液和变性反应在分装在100 ° C时10分钟。 脉冲离心机把液体的试管底部，减少污染的危险。 剩余样品放置在加热块，并在30 ° C孵育60分钟。 15μl删除10分钟，60分钟的时间点，并在100此外4X SDS样品缓冲液和变性5μL终止反应° C。 脉冲离心机把液体的试管底部，减少污染的危险。 3。免疫样品和分析结果样本上运行的SDS – PAGE 10 4-12％二 – 三polyacrilamide凝胶电泳准备使用MOPS运行缓冲。 每个样品20μL装上凝胶锐器7μlTAIN蛋白质标准的阶梯。 凝胶在160V运行90分钟，或直至染料前沿到达凝胶年底。 所有液体接触放射性同位素应作为放射性废物处理和处置按机构指引。伦敦大学学院规定的状态，液体放射性废物的，应当由具有丰富的水倾泻而下指定的放射性处置汇丢弃。 通过免疫印迹蛋白转移到PVDF膜上。 传输缓冲区准备，1X三甘氨酸加20％甲醇。 PVDF膜和滤纸切，以正确的凝胶大小和膜或在滤纸的情况下转移缓冲液预湿的情况下，冰川甲醇激活。膜应标有圆珠笔油墨，以便识别取向。 凝胶中删除从PLASTIC外壳和多余的丙烯酰胺和处置放射性废物。 凝胶应形成一个三明治膜和滤纸，确保无气泡膜和凝胶之间存在，然后安排在与膜之间的凝胶和阳极的免疫印迹仪器。 转让在25V进行16个小时。 蛋白转移到PVDF膜，应在室温下干燥。最后，应该是孤立的干燥膜醋酸纤维素片之间，接触到一个荧光屏或X光片，让放射性同位素标记蛋白检测。曝光时间可以从几个小时，超过一周取决于使用放射性同位素和酶的反应动力学的具体活动。 Phosphoscreen扫描/电影处理。如果使用荧光屏，图像应保存为一个高分辨率的TIFF或位图文件，如果使用胶片，然后由此产生的TRANsparency应该使用的是台式扫描仪扫描，并保存为高分辨率的TIFF或位图文件。分析图像，然后可以在ImageJ，一个免费程序，在国家卫生部网站（ 上提供http://rsbweb.nih.gov/ij/ ）。 4。代表性的成果图1显示了代表进行了一个试验使用作为一种通用的磷酸受体底物髓鞘碱性蛋白野生型，G2019S和D1994A LRRK2结果。 LRRK2自身磷酸化≈200kDa是可见的，与代表从20 – 40kDa的磷酸化的MBP可见多个频段。注意在D1994A（激酶死）车道的情况下的自身磷酸化，并增加磷酸化由于G2019S突变。注意还残留的MBP磷酸化激酶死巷。这可能是由于不完全消融D1994A突变的LRRK2激酶活性，或反映的存在Øf跟踪污染的反应激酶。 图1。

Discussion

本文介绍了一种用于化验的LRRK2的激酶活性，在体外系统的基本协议。在简洁的利益，这已不限于一小时的终点模板，使用一个通用的基板，但一般协议是适用于潜在的承印物范围，适合更复杂的分析研究LRRK2激酶活性的动力学。这突出表明利用体外系统研究，像这样的一种蛋白激酶行为的关键优势之一：酶和底物的浓度，因为有完整的控制，它可以生成动力学数据和_计算的K m和V _最大值反应。对于更详细的动力学评价或公认的抑制剂的影响进行评估的，更高的吞吐量系统（如使用LRRKtide基板，自Invitrogen提供）的是一个优越的alternati已经在这里介绍的方法。

这一点很重要，但是，认识到还原模型在体外激酶分析系统提供的是一个工具来检查生物学激酶和其潜在基板之间的关系。像这样的检测数据应在与其他方法结合使用激酶如何在体外和行为在一个细胞的背景下，以获得全面的了解。例如， 在体外磷酸化的一个公认的基板可以通过质谱分析，以确定有针对性的突变（如转换的丝氨酸或苏氨酸磷酸受体残基丙氨酸，如无phosphorylatable残留），然后可以通过操纵研究功能可能phosphosites磷酸体外的后果。

在体外检测系统如在解释数据的一个主要考虑因素是eithe可能性R型I或II型错误（假阳性或假阴性）。不幸的是，该系统的还原性质作主既 – 在前者的情况下，有一个纯化假定在人为地接近，并在高浓度的底物和纯化激酶（蜂窝环境相比）可能会导致artefactual磷酸化事件。相反，作为一个复杂的一部分，许多激酶的功能内的细胞中，并要求一个给定的基材发生磷酸化的共同因素。如上所述，从一个假定的底物磷酸化的积极结果在体外检测系统使用，那么应该是在蜂窝系统测试验证结果和阴性结果应谨慎解释。

鉴于这种情况，这是关键，可能有正反两方面的控制，让您感兴趣的激酶活性的比较研究。仔细选择了积极控器升，有一个对你感兴趣的蛋白质知名的活动，与阴性对照，是不太可能的磷酸化公认的基板，是极其宝贵的。一个LRRK2候选人控制受体相互作用的激酶3，其中有一个密切相关的主序列激酶结构域的LRRK2，但有一个非常不同的总体^域结构18。这是从Invitrogen公司的重组蛋白，并作为标准控制在我们的实验室使用。

还应当指出的是，市售的LRRK2形式缺乏的蛋白质N -末端和谷胱甘肽- S -转移，这应该被视为一个潜在的混杂因素考虑在进行这种蛋白激酶检测标签，因为它是不知道什么样的作用N -末端的LRRK2这种蛋白质发挥正常功能。例如，如果在这个协议中的部分是缺席的蛋白质N -末端的LRRK2是招聘的LRRK2激酶结构域的一个特定的基板关键，那么这将有一个观察磷酸化产生重大影响，在体外系统的基板上面描述。

即使这些前提条件，然而，帕金森氏研究LRRK2生物学的重要性，强调作为一个有价值的工具，在调查这种蛋白质的行为 ，在体外设置本议定书的效用。

Materials

Reagent	Company	Catalogue Number	Comment
LRRK2 wild type	Invitrogen	PV4873
LRRK2 G2019S	Invitrogen	PV4881
LRRK2 D1994A	Invitrogen	PV6051
Kinase buffer	Cell Signalling	9802S
MBP	Sigma	M1891
32P g ATP	Perkin Elmer	BLU002X500UC	500µCi, 30Ci /mMole
4x LDS sample buffer	Invitrogen	NP0007
2-Mercaptoethanol	Sigma	M6250
Protein standards	Invitrogen	LC5800
MOPS running buffer	Invitrogen	NP0001
Bis-tris acrylamide gel	Invitrogen	NP0321	4-12% 1mm 10well
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
Transfer buffer	Invitrogen	NP0006

Table 1. Reagents

Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps

Equipment type	Company	Comment
Geiger counter	Mini Instruments
SDS PAGE tank	Invitrogen
Transfer tank	Invitrogen
Heat blocks (2)	Eppendorf
Phosphor screen	GE	X-ray film can be substituted
Phosphor imager	GE
Exposure cassette	GE
Centrifuge	Eppendorf
Perspex shielding
1.5ml tubes	VWR	Screw top with O ring

Table 2. Equipment