المنسدلة من كالمودولين ملزم البروتينات
Summary
كالمودولين (CAM) المنسدلة مقايسة هو وسيلة فعالة لتحقيق التفاعل بين كام مع البروتينات المختلفة. يستخدم هذا الأسلوب CAM – sepharose الخرز لتحليل كفاءة والمحددة للكاميرا ملزم البروتينات. وهذا يوفر أداة مهمة لاستكشاف إشارات كاميرا في وظيفة الخلوية.
Abstract
الكالسيوم (كا 2 +) هو ايون حيويا في تنظيم وظيفة الخلوية من خلال مجموعة متنوعة من الآليات. الكثير من الكالسيوم 2 + هو بوساطة من خلال إشارات البروتين الكالسيوم الملزمة المعروفة 1،2 (CAM) كالمودولين. وتشارك CAM على مستويات متعددة في جميع العمليات الخلوية تقريبا ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج ، والتمثيل الغذائي ، على نحو سلس تقلص العضلات ، اللدونة متشابك والنمو العصبي ، والتهاب والاستجابة المناعية. وهناك عدد من البروتينات تساعد على تنظيم هذه المسارات من خلال تفاعلها مع كاميرا. كثير من هذه التفاعلات تعتمد على التشكل من كاميرا ، والتي تختلف اختلافا واضحا عندما منضما إلى الكالسيوم 2 + (كا 2 + – CAM) مقابل حالته + خالية كا 2 (ApoCaM) 3.
في حين أن معظم البروتينات الهدف ربط كا 2 + كام ، ربط بروتينات معينة فقط لApoCaM. كاميرا من خلال ربط بعض المجال الذكاء ، بما في ذلك neuromodulin 4 ، neurogranin (نغ) 5 ، وبعض myosins <sup> 6. وقد تبين أن هذه البروتينات تلعب دورا هاما في وظيفة قبل المشبكي 7 ، 8 وظيفة بعد المشبكي ، وتقلص العضلات 9 ، على التوالي. قدرتها على ربط وإطلاق كاميرا في غياب أو وجود الكالسيوم 2 + لها دور محوري في وظيفتها. في المقابل ، ربط العديد من البروتينات فقط كا 2 + – CAM ، وتتطلب هذه ملزمة لتفعيلها. وتشمل الأمثلة على ضوء سلسلة الميوسين كيناز 10 ، كا 2 + / CAM التي تعتمد على كاينيسات (CaMKs) 11 وphosphatases (مثل الكالسينيورين (calcineurin)) 12 ، وإسبكترن كيناز 13 ، التي لديها مجموعة متنوعة من الآثار المباشرة والمصب 14.
الآثار المترتبة على هذه البروتينات الخلوية على وظيفة غالبا ما تعتمد على قدرتها على ربط كاميرا بطريقة تعتمد على الكالسيوم + 2. على سبيل المثال ، نحن اختبار مدى ملاءمة NG – CAM ملزمة في وظيفة متشابك وكيف تؤثر هذه الطفرات المختلفة ملزمة. ولدت لدينا يخدع نغ GFP الموسومةالبنية مع طفرات معينة في المجال الذكاء من شأنها أن تغير قدرة نغ لربط كاميرا بطريقة تعتمد على الكالسيوم + 2. وقدم دراسة هذه الطفرات المختلفة لنا نظرة كبيرة في عمليات هامة تشارك في وظيفة متشابك 8،15. ومع ذلك ، في مثل هذه الدراسات ، فمن الضروري أن تثبت أن البروتينات المتحورة والربط المتوقع تغييرها لكاميرا.
هنا ، نقدم طريقة لاختبار قدرة البروتينات لربط كاميرا في وجود أو عدم وجود الكالسيوم 2 + ، وذلك باستخدام وكناس CaMKII نغ كأمثلة. هذا الأسلوب هو شكل من أشكال التقارب اللوني ويشار إلى مقايسة المنسدلة CAM. ويستخدم CAM – Sepharose الخرز لاختبار البروتينات التي تربط لكاميرا وتأثير الكالسيوم 2 + على هذا الربط. حان الوقت أكثر من ذلك بكثير ويتطلب كفاءة وأقل من البروتين بالنسبة إلى العمود اللوني وفحوصات أخرى. تماما ، وهذا يوفر أداة قيمة لاستكشاف كا 2 + / CAM إشارات والبروتينات التي فيteract مع كاميرا.
Protocol
Discussion
البروتوكول شريطة يستخدم CAM – sepharose الخرز للتحقيق في كا 2 + الاعتماد على كاميرا ملزم البروتينات. العديد من البروتينات ربط كاميرا بطريقة تعتمد على الكالسيوم + 2. هذه التفاعلات هي ذات أهمية كبيرة نظرا لعدد CAM ملزم البروتينات ودورها الحيوي في العديد من مسارات الإ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر تيفاني الكرز في مساعدتها في تحسين هذا البروتوكول. وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق المعهد الوطني للشيخوخة (AG032320) ، وكذلك النهوض أكثر صحة ولاية ويسكونسن.
Materials
| Product | Company | Catalogue number | Notes |
| Calmodulin-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0529-01 | |
| Anti-CamKII alpha | Sigma-Aldrich | C6974 | |
| Anti-neurogranin | Millipore | 07-425 | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher | 02-707-138 | Use for aspiration of supernatants |
| Microcentrifuge tubes (2.0 mL) | Fisher | 05-408-146 | Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads |
References
- Vincenzi, F. F. Calmodulin in the regulation of intracellular calcium. Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).
- Cheung, W. Y. Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation. Science. 207, 19-27 (1980).
- Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin. Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).
- Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein. J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).
- Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain. Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).
- Bahler, M., Rhoads, A. Calmodulin signaling via the IQ motif. FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).
- Routtenberg, A. Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth. Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).
- Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).
- Needham, D. M. Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction. Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).
- Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).
- Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain. J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).
- Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).
- Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes. Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).
- Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. Calmodulin’s flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides. Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).
- Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
