Fluxos de medição de cálcio rápido no Cardiomyocytes

Summary

Nós apresentamos um método para isolar rápido eventos (microssegundo) cálcio dos fluxos mais lento em células vivas usando laser microscopia confocal. O método mede as flutuações de intensidade de fluorescência de indicadores de cálcio através dos exames de gravação de linha de várias centenas de pixels em uma célula. Análise de histograma nos permite isolar as escalas de tempo de fluxos de cálcio diferentes.

Abstract

Cardiomiócitos ter vários fluxos de Ca ^{2 +} de duração variável que trabalham em conjunto para otimizar ^1,2 função. Mudanças na atividade Ca ^{2 +} em resposta a agentes extracelular é normalmente regulada pela fosfolipase caminho _q Cβ-Gα localizada na membrana plasmática, que é estimulado por agentes como a acetilcolina ^3,4. Nós temos encontrado recentemente que os domínios membrana plasmática proteína chamada cavéolas ^5,6 pode prender ativado Gα _q ^7. Esta armadilha tem o efeito de estabilizar o estado de ativação de Gα _q e resultando em prolongada Ca ^{2 +} sinais em cardiomiócitos e outros tipos de células ^8. Descobrimos este resultado surpreendente, medindo as respostas dinâmicas de cálcio em uma escala rápida em cardiomiócitos vida. Resumidamente, as células são carregados com uma fluorescente indicador Ca ^{+ 2.} Em nossos estudos, utilizamos Ca ^{2 +} Verde (Invitrogen, Inc.), que apresenta um aumento na intensidade de emissão de fluorescência mediante ligação de íons de cálcio. A intensidade de fluorescência é então gravado para usar um modo de linha de varredura de um microscópio confocal de varredura a laser. Este método permite a aquisição rápida do curso de tempo da intensidade de fluorescência em pixels ao longo de uma linha selecionada, produzindo centenas de vestígios do tempo na escala de tempo de microsegundos. Esses traços muito rápidos são transferidos para excel e depois em SigmaPlot para análise, e são comparados aos vestígios obtidos para ruído eletrônico, corante livre, e outros controles. Para dissecar Ca ^{2 +} respostas das taxas de fluxo diferentes, foi realizada uma análise de histograma que binned intensidades de pixels com o tempo. Binning permite-nos agrupar mais de 500 rastros de scans e visualizar os resultados compilados espacial e temporalmente em uma única parcela. Assim, a lenta Ca ^{2 +} ondas que são difíceis de discernir quando os exames são sobrepostas, devido à colocação de pico diferente e ruído, pode ser facilmente visto emos histogramas binned. Fluxos muito rápido na escala de tempo da medição mostram uma estreita distribuição de intensidades nas caixas de tempo muito curto enquanto Ca ^{2 +} mais ondas de mostrar dados binned com uma ampla distribuição ao longo escaninhos mais tempo. Essas distribuições de tempo diferentes nos permitem dissecar o momento de Ca ^{2 +} fluxos nas células, e para determinar o seu impacto em vários eventos celulares.

Protocol

1. Células de carga com indicadores de cálcio Células da placa de vidro em 35mm pratos fundo Mattek (ou qualquer outro fundo de vidro visualização câmaras). Se estiver usando casaco de miócitos primário das câmaras de um dia antes com 10μg/ml laminina. Miócitos cardíacos placa (isoladas de cães adultos, ratos neonatal, ou outro organismo) em KB de buffer (K-reversão tampão Tyrode 35 mmol / L de HEPES, 140 mmol / L de KCl, 8 mmol / L de KHCO 3, 2 mmol / L de MgCl 2</sub…

Discussion

Nós desenvolvemos um método para ver e isolar sinais de cálcio em cardiomiócitos rápida vivos. Enquanto as condições experimentais dessas medidas tenham sido previamente aplicado a sistemas de células de outros ^10, assim como cardiomiócitos ^11, o uso de histogramas e análise bin permite que dados de Ca ^{2 +} muitos eventos a serem adquiridos. Eventos mais rápidos podem ser facilmente isoladas de mais lentas e modelos adaptados para compreender seus mecanismos subjacentes. Cardio…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234