Immunocoloration des Disséqué coeur embryonnaire Zebrafish
Summary
Un moyen rapide pour effectuer immunocoloration des embryons de poisson zèbre coeur est décrite. Comparativement à l'approche immunologique monter ensemble, cette méthode augmente considérablement la pénétration de l'anticorps, ce qui permet d'obtenir des images haute résolution qui révèlent des structures cellulaires / subcellulaires dans le coeur dans un temps de traitement beaucoup plus réduite.
Abstract
L'embryon de poisson zèbre devient un populaire dans le modèle in vivo pour l'étude des vertébrés développement cardiaque et les maladies cardiaques humaines en raison de sa embryologie et la génétique avantageuse 1,2. Environ 100-200 embryons sont disponibles chaque semaine d'un seul couple de poissons adultes. Les embryons transparents qui se développent ex utero les rendent idéales pour évaluer les défauts cardiaques 3. L'expression de tout gène peut être manipulé par l'intermédiaire morpholino la technologie d'injection ou de l'ARN 4. Par ailleurs, avant de cribles génétiques ont déjà généré une liste de mutants qui affectent différentes perspectives de cardiogenèse 5.
Whole immunomarquage de montage est une technique importante dans ce modèle animal de révéler le profil d'expression de la protéine ciblée à un tissu particulier 6. Toutefois, les images à haute résolution qui peut révéler des structures cellulaires ou subcellulaires ont été difficiles, principalement en raison de la locat physiquesion du cœur et la faible pénétration de l'anticorps.
Ici, nous présentons une méthode pour répondre à ces goulots d'étranglement en disséquant le cœur d'abord et ensuite la conduite du processus de taches sur la surface d'une lame de microscope. Pour éviter la perte des échantillons de petit coeur et pour faciliter la manipulation solution, nous avons limité les échantillons coeur dans un cercle à la surface du microscope diapositives tirées par un stylo immEdge. Après la coloration, les signaux de fluorescence peut être directement observé par un microscope composé.
Notre nouvelle méthode améliore significativement la pénétration des anticorps, car un cœur à partir d'un embryon de poisson ne se compose que de quelques couches de cellules. Des images de haute qualité de coeurs intacts peuvent être obtenus dans un délai très réduit pour le défilé des embryons de poisson zèbre âgés de jour 2 au jour 6. Notre méthode peut être potentiellement étendue à d'autres organes disséqués tache soit de poisson zèbre ou autres petits animaux.
Protocol
Discussion
Comparé à l'ensemble des méthodes classiques immunomarquage monter, notre méthode présente les avantages suivants. D'abord, beaucoup plus fort des signaux fluorescents peuvent être systématiquement obtenu grâce à une meilleure pénétration. Dans la méthode immunologique monter ensemble, les tissus de la peau épaisse qui entoure le cœur significativement réduit la pénétration de nombreux anticorps, résultant en bruit de fond élevé dans le corps entier. Ce problème est particulièrement grave p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Beninio Jomok pour son aide dans le poisson-zèbre élevage. Ce travail est financé par le NIH HL81753.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| tricaine | Research organics | 3007T |
| Formaldehyde | Polysciences | 04018 |
| Insulin syringe | Becton Dickinson | 329461 |
| Triton-X-100 | Sigma | T8532 |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma | C7207 |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotech | SC313 |
| F59 | Zfin | |
| Anti-α-actinin antibody | Sigma | A7811 |
| Anti-Ilk antibody | Cell signaling | #3862 |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 |
| Mounting medium for fluorescence | Vector | H-1200 |
| ImmEdge pen | Vector | H-4000 |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron microscopy sciences | 63410-01 |
| Microscope cover glass | Fisher | 12-543-D |
| Concaved microscope slides | Fisher | 7-1305-8 |
| Dissection microscope | Leica MZ95 | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioplan2 |
| ApoTome | Zeiss |
PBST:
1 x PBS
0.5% Triton-X 100
25X Tricaine:
400 mg Tricaine
97.9 mL ddH2O
2.1 mL (1M Tris pH9)
Adjust pH to 7.0
References
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