Dissected Zebrafish भ्रूण हार्ट के Immunostaining
Summary
एक तेजी से zebrafish भ्रूण दिल की immunostaining आचरण में वर्णित है. पूरे माउंट immunostaining दृष्टिकोण की तुलना में, इस विधि नाटकीय रूप से एंटीबॉडी, जो उच्च संकल्प छवियों है कि दिल में एक बहुत कम प्रसंस्करण समय के भीतर सेलुलर / subcellular संरचनाओं प्रकट प्राप्त करने की अनुमति देता है की पहुंच बढ़ जाती है.
Abstract
Zebrafish भ्रूण हृदय विकास और मानव हृदय अपने फायदेमंद भ्रूणविज्ञान और 1,2 आनुवंशिकी के कारण रोगों का अध्ययन करने के लिए vivo हड्डीवाला मॉडल में लोकप्रिय हो जाता है. 100-200 भ्रूण के बारे में आसानी से उपलब्ध वयस्क मछली की एक जोड़ी से हर हफ्ते हैं. पारदर्शी भ्रूण कि पूर्व utero विकसित उन्हें हृदय दोष 3 आकलन के लिए आदर्श बनाते हैं. किसी भी जीन की अभिव्यक्ति morpholino प्रौद्योगिकी या शाही सेना इंजेक्शन 4 के माध्यम से चालाकी से किया जा सकता है. इसके अलावा, आगे आनुवंशिक स्क्रीन पहले से ही म्यूटेंट की एक सूची है कि 5 कार्डियोजेनेसिस के अलग अलग दृष्टिकोण को प्रभावित उत्पन्न किया है.
पूरे माउंट immunostaining इस पशु मॉडल में एक महत्वपूर्ण तकनीक के लिए एक विशेष ऊतकों को 6 लक्षित प्रोटीन की अभिव्यक्ति पैटर्न पता चलता है . हालांकि, उच्च संकल्प छवियों है कि सेलुलर या subcellular संरचनाओं प्रकट कर सकते हैं मुश्किल हो गया है, मुख्य रूप से शारीरिक locat के कारणदिल और एंटीबॉडी के गरीब पैठ आयन.
यहाँ, हम हृदय विदारक पहली बार और फिर एक खुर्दबीन स्लाइड की सतह पर धुंधला हो जाना प्रक्रिया का आयोजन द्वारा इन बाधाओं को पता करने के लिए करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. छोटे दिल के नमूने की हानि को रोकने के लिए और समाधान से निपटने की सुविधा के लिए, हम एक सर्कल के भीतर माइक्रोस्कोप के सतह स्लाइड एक immEdge कलम द्वारा तैयार पर दिल के नमूने प्रतिबंधित. धुंधला के बाद, प्रतिदीप्ति संकेतों सीधे एक यौगिक सूक्ष्मदर्शी द्वारा मनाया जा सकता है.
हमारी नई विधि में काफी एंटीबॉडी के लिए प्रवेश में सुधार के बाद से एक भ्रूण मछली से एक दिल केवल कुछ सेल परतों के होते हैं. बरकरार दिल से उच्च गुणवत्ता छवियों zebrafish भ्रूण दिन 2 से 6 दिन के लिए आयु वर्ग के लिए एक बहुत कम बारात समय के भीतर प्राप्त किया जा सकता है. हमारी विधि संभावित अन्य अंगों या तो zebrafish या अन्य छोटे जानवरों से dissected दाग विस्तारित कर सकते हैं.
Protocol
Discussion
क्लासिक पूरे माउंट immunostaining तरीकों की तुलना में, हमारे विधि निम्नलिखित फायदे हैं. सबसे पहले, बहुत मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत लगातार सुधार पैठ के कारण प्राप्त कर सकते हैं. पूरे माउंट immunostaining विधि में, घने त्वचा द?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Beninio Jomok zebrafish पालन में उनकी मदद के लिए धन्यवाद. इस काम HL81753 NIH द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| tricaine | Research organics | 3007T |
| Formaldehyde | Polysciences | 04018 |
| Insulin syringe | Becton Dickinson | 329461 |
| Triton-X-100 | Sigma | T8532 |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma | C7207 |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotech | SC313 |
| F59 | Zfin | |
| Anti-α-actinin antibody | Sigma | A7811 |
| Anti-Ilk antibody | Cell signaling | #3862 |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 |
| Mounting medium for fluorescence | Vector | H-1200 |
| ImmEdge pen | Vector | H-4000 |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron microscopy sciences | 63410-01 |
| Microscope cover glass | Fisher | 12-543-D |
| Concaved microscope slides | Fisher | 7-1305-8 |
| Dissection microscope | Leica MZ95 | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioplan2 |
| ApoTome | Zeiss |
PBST:
1 x PBS
0.5% Triton-X 100
25X Tricaine:
400 mg Tricaine
97.9 mL ddH2O
2.1 mL (1M Tris pH9)
Adjust pH to 7.0
References
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E. Muscle: the regulation of myogenesis. Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 745-751 (1994).
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A. Cadherins and associated proteins. Vivo. 5, 505-513 (1991).
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
