Vi har utviklet en ny metode for å kvantifisere nikotin acetylkolin reseptor endringer innenfor subcellulære regioner i bestemte undergrupper av CNS neurons å bedre forstå mekanismene for nikotinavhengighet ved hjelp av en kombinasjon av tilnærminger, inkludert fluorescerende protein merking av reseptoren med knock-in tilnærming og spektrale confocal bildebehandling.
Ligand-gated ionekanaler i sentralnervesystemet (CNS) er innblandet i en rekke tilstander med alvorlige medisinske og sosiale konsekvenser. For eksempel, er avhengighet av nikotin via tobakksrøyking en ledende årsak til for tidlig død på verdensbasis (World Health Organization) og er sannsynligvis forårsaket av en endring av ionekanal fordeling i hjernen en. Kronisk nikotin eksponering i både gnagere og mennesker gir økte antall nikotin acetylkolinreseptorer (nAChRs) i hjernevev 1-3. Tilsvarende har endringer i de glutamatergic GluN1 eller GluA1 kanaler vært innblandet i å utløse overfølsomhet mot andre avhengighetsskapende stoffer som kokain, amfetamin og opiater 4-6.
Derfor er evnen til å kartlegge og kvantifisere distribusjon og uttrykk mønstre av spesifikke ionekanaler kritisk viktig å forstå mekanismene for avhengighet. Studiet av hjernen region-spesifikk efvirkningene av enkelte legemidler ble fremmet ved ankomsten av teknikker som radioaktive ligander. Imidlertid hindrer lav romlig oppløsning av radioaktivt ligand binding muligheten til å kvantifisere ligand-gated ionekanaler i bestemte undergrupper av nerveceller.
Genetisk kodet fluorescerende reportere, som for eksempel grønn fluorescerende protein (GFP) og sine mange fargevarianter, har revolusjonert innen biologi 7. Ved genetisk tagging en fluorescerende reporter til en endogen protein man kan visualisere proteiner in vivo 7-10. En fordel med fluorescently tagging proteiner med en sonde er eliminering av antistoff bruk, som har spørsmål om nonspecificity og tilgjengelighet til målet protein. Vi har brukt denne strategien for å fluorescently label nAChRs, som gjorde studiet av reseptoren montering bruke Förster Resonance Energy Transfer (FRET) i transfekterte dyrkede celler 11. Mer nylig har vi brukt knock-i tilnærming til ingeniør mus med gul fluoriserende protein tagget α4 nAChR subenheter (α4YFP), slik at nøyaktig kvantifisering av reseptoren ex vivo ved submicrometer oppløsning i CNS nevroner via spektral konfokalmikroskopi 12. Den målrettede fluorescerende knock-in mutasjon er innlemmet i den endogene locus og under kontroll av sin opprinnelige arrangøren, produserer normale nivåer av uttrykk og regulering av reseptoren i forhold til ukodede reseptorer i hvete mus. Dette knock-in tilnærming kan utvides til fluorescently tagge andre ionekanaler, og tilbyr en kraftig tilnærming av visualisere og kvantifisere reseptorer i CNS.
I dette notatet beskriver vi en metode for å kvantifisere endringer i nAChR uttrykk i spesifikke CNS nevroner etter eksponering til kronisk nikotin. Våre metoder omfatter mini-osmotisk pumpe implantasjon, intrakardiale perfusjon fiksering, bildebehandling og analyse av fluorescently merket nikotinsyre receptor subenheter fra α4YFP knock-in mus (Fig. 1). Vi har optimalisert fiksering teknikken for å minimere autofluorescens fra fast hjernen tissue.We beskrive i detalj vår avbildning metodikk ved hjelp av en spektral confocal mikroskop i forbindelse med en lineær spektral unmixing algoritme for å trekke autofluoresent signal for å oppnå nøyaktig α4YFP fluorescens signal. Til slutt viser vi resultater av kronisk nikotin-indusert oppregulering av α4YFP reseptorer i den mediale perforant banen til hippocampus.
The authors have nothing to disclose.
Anthony Renda ble støttet av en University of Victoria Graduate Fellowship Award. Denne forskningen ble støttet av en Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant, en NARSAD Young Investigator Award (til RN), en Victoria Foundation – Myre og Winifred sim Fund, en kanadisk Foundation for Innovation bevilgning, en British Columbia Kunnskap utviklingsfond og en Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Research Verktøy og Instrumentation Grant. Vi takker Jillian McKay, Christina Barnes, Ariel Sullivan, Jennifer MacDonald og Daniel Morgado for utmerket mus underhaldande.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
mini-osmotic pumps | Alzet | model 2002 | |
saline | Teknova | S5819 | |
(-)-nicotine hydrogen tartrate salt | Sigma | N5260 | |
eye drops | Novartis | Tear-Gel | |
Vetbond glue | 3M | 1469SB | |
heparin sodium salt | Sigma | H4784 | |
10x PBS | Invitrogen | 70011 | |
ketamine | Wyeth Animal Health | 0856-4403-01 | |
medatomidine hydrochloride | Pfizer | 1950673 | |
23G butterfly needle | Becton Dickinson | 367253 | |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
plastic embedding mold | VWR | 18986-1 | |
O.C.T. Mounting Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Mowiol 4-88 | EMD-Calbiochem | 475904 | pH 8.5 |