وفي اشارة الى نقص الأوكسجين داخل تعقب المجاميع خلية مغلف

Summary

تم وصف طريقة لتغليف الخلايا الضوئية الشمسية في هيدروجيل PEG crosslinked. يتم تعقب إشارات ميتة داخل ورم جزيري الفئران مغلفة (MIN6) المجاميع باستخدام نظام علامة الفلورسنت. يسمح هذا النظام التسلسلي للفحص الخلايا في غضون سقالة هيدروجيل ويشير ارتباط نقص الأوكسجين مع التغيرات في النمط الظاهري الخلية.

Abstract

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic β-cells results in loss of insulin production and potentially lethal hyperglycemia. As an alternative treatment option to exogenous insulin injection, transplantation of functional pancreatic tissue has been explored^1,2. This approach offers the promise of a more natural, long-term restoration of normoglycemia. Protection of the donor tissue from the host’s immune system is required to prevent rejection and encapsulation is a method used to help achieve this aim.

Biologically-derived materials, such as alginate³ and agarose⁴, have been the traditional choice for capsule construction but may induce inflammation or fibrotic overgrowth⁵ which can impede nutrient and oxygen transport. Alternatively, synthetic poly(ethylene glycol) (PEG)-based hydrogels are non-degrading, easily functionalized, available at high purity, have controllable pore size, and are extremely biocompatible,^6,7,8. As an additional benefit, PEG hydrogels may be formed rapidly in a simple photo-crosslinking reaction that does not require application of non-physiological temperatures^6,7. Such a procedure is described here. In the crosslinking reaction, UV degradation of the photoinitiator, 1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one (Irgacure 2959), produces free radicals which attack the vinyl carbon-carbon double bonds of dimethacrylated PEG (PEGDM) inducing crosslinking at the chain ends. Crosslinking can be achieved within 10 minutes. PEG hydrogels constructed in such a manner have been shown to favorably support cells^7,9, and the low photoinitiator concentration and brief exposure to UV irradiation is not detrimental to viability and function of the encapsulated tissue¹⁰. While we methacrylate our PEG with the method described below, PEGDM can also be directly purchased from vendors such as Sigma.

An inherent consequence of encapsulation is isolation of the cells from a vascular network. Supply of nutrients, notably oxygen, is therefore reduced and limited by diffusion. This reduced oxygen availability may especially impact β-cells whose insulin secretory function is highly dependent on oxygen^11-13. Capsule composition and geometry will also impact diffusion rates and lengths for oxygen. Therefore, we also describe a technique for identifying hypoxic cells within our PEG capsules. Infection of the cells with a recombinant adenovirus allows for a fluorescent signal to be produced when intracellular hypoxia-inducible factor (HIF) pathways are activated¹⁴. As HIFs are the primary regulators of the transcriptional response to hypoxia, they represent an ideal target marker for detection of hypoxic signaling¹⁵. This approach allows for easy and rapid detection of hypoxic cells. Briefly, the adenovirus has the sequence for a red fluorescent protein (Ds Red DR from Clontech) under the control of a hypoxia-responsive element (HRE) trimer. Stabilization of HIF-1 by low oxygen conditions will drive transcription of the fluorescent protein (Figure 1). Additional details on the construction of this virus have been published previously¹⁵. The virus is stored in 10% glycerol at -80° C as many 150 μL aliquots in 1.5 mL centrifuge tubes at a concentration of 3.4 x 10¹⁰ pfu/mL.

Previous studies in our lab have shown that MIN6 cells encapsulated as aggregates maintain their viability throughout 4 weeks of culture in 20% oxygen. MIN6 aggregates cultured at 2 or 1% oxygen showed both signs of necrotic cells (still about 85-90% viable) by staining with ethidium bromide as well as morphological changes relative to cells in 20% oxygen. The smooth spherical shape of the aggregates displayed at 20% was lost and aggregates appeared more like disorganized groups of cells. While the low oxygen stress does not cause a pronounced drop in viability, it is clearly impacting MIN6 aggregation and function as measured by glucose-stimulated insulin secretion¹⁵. Western blot analysis of encapsulated cells in 20% and 1% oxygen also showed a significant increase in HIF-1α for cells cultured in the low oxygen conditions which correlates with the expression of the DsRed DR protein.

Protocol

1. PEGDM التوليف ومتفاعل للضوء حل macromer إعداد PEGDM تزن 2G من PEG (خطي ، 10،000 دا) إلى قارورة زجاجية 40mL مع غطاء من البلاستيك الصلب. إضافة 308μL تقريبا أنهيدريد ميثاكريليك فضفاضة وغطاء القارورة. القارورة الميكروويف على ارتفاع لمدة 2 دقيقة في الميكروويف محلية القياسية. قفازات مقاومة للحرارة لبس ، دوامة القارورة جيدا ، ثم الميكروويف على ارتفاع لمدة 5 دقائق إضافية. السماح لفترة وجيزة القارورة ليبرد بما يكفي ليكون التعامل معها قفازات. إرفع قبعة وإضافة ببطء في حين يحوم كلوريد الميثيلين القارورة. إضافة كافية بحيث يبدو الحل واضح ومتجانس ، vortexing العينة حسب الحاجة. وينبغي أن إجمالي حجم كلوريد الميثيلين استخدامها 1،5-2 مل. PEGDM يعجل في 200 مل من البرد ، أثار إثيل الأثير عن طريق إضافة قطرة قطرة الحل. جمع PEGDM الفراغ عن طريق الترشيح واتركه حتى يجف. حل PEGDM في كمية كافيةمن الماء منزوع الأيونات (عادة 100 -150 مل). Dialyze الحل ضد الماء منزوع الأيونات لمدة 5 أيام في أنابيب غسيل الكلى مع الوزن الجزيئي قطع من 1000 دا. استبدال المياه مرة واحدة يوميا. قسامة الحل في حاويات مناسبة والتجميد في -80 درجة مئوية خلال الليل. Lyophilize الحل لمدة 4 أيام لتنقية تسفر عن مسحوق أبيض PEGDM. تخزين مسحوق عند 4 درجة مئوية عندما لا تكون قيد الاستعمال. لإعداد حل PEGDM متفاعل للضوء ، وإعداد لأول مرة في المائة من الوزن 0.5 photoinitiator حل الأسهم عن طريق تذويب Irgacure 2959 في الماء منزوع الأيونات. دوامة الحل وتخزينه في الظلام. إعداد 10 ٪ بالوزن وPEGDM 0.025 ٪ بالوزن Irgacure 2959 حل في محلول هانك في سولت المتوازن (HBSS). دوامة بدقة لضمان حل PEGDM. نحن نستعد عادة 1mL هذا الحل في وقت واحد. تعقيم حل عن طريق التصفية عليه من خلال تصفية حقنة 0.2 ميكرومتر في أنبوب مل microcentrifuge 1.8. التفاف أنبوب في رقائق الألومنيوموتخزينها في 4 درجات مئوية 2. والثقافة ، والعدوى ، وتجميع الخلايا MIN6 تستزرع MIN6 الخلايا في المتوسط ​​1640 RPMI تستكمل مع FBS 10 ٪ والجلوكوز 7mM ، 100 وحدة / مل البنسلين / الستربتومايسين ، و0.5 ميكروغرام / مل ب amphotercin في بيئة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. الافراج عن الخلايا من سطح القارورة ثقافة المعالجة ، ونضح والمتوسطة ، وشطف الخلايا مع 37 درجة مئوية الكالسيوم / المغنيسيوم خالية HBSS ، ونضح HBSS ، ثم يضاف 2 مل من 37 درجة مئوية التربسين – EDTA الحل وتسمح للخلايا احتضان لمدة 3 دقائق. جرة بحزم الى جانب القارورة لضرب الخلايا الحرة ، ثم تضاف 8 مليلتر من 37 درجة مئوية والمتوسطة بقوة ماصة تعليق الخلية أعلى وأسفل مع الحرص على عدم إدخال الفقاعات. ماصة الخلايا في العقيمة 15 مل أنبوب الطرد المركزي ، وإجراء تعداد خلايا باستخدام عدادة الكريات أو خلية أخرى العد الداخلي. في الاستعداد لتصيب الخلايا مع صانعالفيروس ، أولا تحديد العدد الكلي للخلايا المصابة ويكون لحساب حجم تعليق الفيروس اللازمة لتحقيق تعدد المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية) (5-10 الجزيئات المعدية في الخلية). تمييع الفيروس في HBSS بواسطة pipeting بعناية كمية مناسبة من التعليق الفيروس إلى وحدة تخزين من قبل aliquoted HBSS في أنبوب مل microcentrifuge 1.8. 50 ميكرولتر من HBSS لكل بئر من الخلايا في مجموعها مناسبة. تفريق الخلايا pipeting لهم صعودا ونزولا في أنبوب بهم ، ثم الماصة حجم اللازمة لتحقيق 400،000 الخلايا لكل بئر من الآبار في تعليق لوحة الثقافة 6 – جيدا. إضافة الحجم المناسب من الفيروس المخفف لكل بئر إلى تحقيق المنشود وزارة الداخلية. إضافة إلى كل بئر المتوسطة لتحقيق حجم يصل الإجمالي إلى 1.7 مل. وضع لوحة على شاكر المداري داخل الحاضنة. تعيين شاكر على إعداد منخفض بحيث المتوسطة يغسل بلطف حول الآبار (~ 100 دورة في الدقيقة). السماح للخلايا لaggregaالشركة المصرية للاتصالات ل24-36 ساعة. وينبغي تشكيل المجاميع التي يبلغ قطرها التقريبي لل75-175 ميكرون. 3. تغليف الخلايا في PEGDM قد تكون مغلفة الخلايا كما تشتت (الخطوة 2.4) أو التجميع التالية (الخطوة 2.10). منذ PEGDM السلائف حل هيدروجيل هو السائل ، قد تميل إلى تسوية الخلايا قبل يشابك وتشكيل هيدروجيل. إذا كان من المتوقع أن تحدث تسوية بسرعة ، كما هو الحال مع المجاميع الكبيرة ، قد يكون من المفيد لانتاج هيدروجيل في خطوتين بحيث تستقر الخلايا إلى الطائرة المركزية للهلام. ويرد التوليف هيدروجيل خطوة واحدة الإجراء المناسب لخلايا متفرقة (الشكل 2) ، ويظهر الإجراء على مرحلتين وكذلك (الشكل 3) ومفصلة أدناه (3،2-3،9). إنشاء السفينة التي سيتم تشكيلها في هيدروجيل بقطع رأس مدبب الخروج من حقنة من البلاستيك 1 مل ووضعه في نهاية المطاف فتح في رفوف. الماصة 20 ميكرولتر من PEGDM متفاعل للضوء ذلكlution في النهاية المفتوحة للحقنة على الغواص التأكد من حجم يغطي سطح المكبس بأكمله. ضبط المكبس بزيادات صغيرة لتحقيق سطح السائل المسطحة. وضع الماصة في رف رف وموقف تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية (365nm ، ~ 7 ميغاواط / سم 2) لحوالي 8 دقائق للسماح لليشابك هيدروجيل. خلال هذا الوقت ، قد بدأت التحضير للخلايا الماصة مجلد يحتوي على العدد المطلوب من الخلايا / المجاميع في أنبوب 1.8 مل microcentrifuge ، وكأب ، والطرد المركزي في أنبوب 130 جرام لمدة 5 دقائق. باستخدام micropipettor ، إزالة بعناية وسائل الإعلام من دون إزعاج بيليه الخلية في طرف الأنبوب. رئيسا وسائل الاعلام النهج بيليه ، فإنه قد يكون من المفيد استخدام الدقيقة ، 10 ميكرولتر طرف الماصة. resuspend بلطف بيليه الخلية في 20 ميكرولتر من محلول PEGDM متفاعل للضوء (استخدام طرف الماصة واسعة الفم إذا كان يعمل مع المجاميع) وإضافة تعليق الخلية إلى حقنة على رأس اله crosslinked سابقا جزء هيدروجيل. فضح المحقنة إلى 8 دقائق إضافية من الأشعة فوق البنفسجية لاستكمال بناء هيدروجيل. عند الانتهاء ، يجب أن تكون خلايا مغلفة بشكل كامل في هيدروجيل اسطواني الشكل (3). إخراج هيدروجيل من المحاقن وعلى 1 مل من HBSS في البئر من 24 لوحة ليغسل جيدا لفترة وجيزة من هلام. نقل الجل إلى 1 مل من وسائل الإعلام في البئر من 24 لوحة جيدا والثقافة وفقا للشروط المطلوبة. 4. تتبع نقص الأكسجة في أي نقطة خلال الصور ، والثقافة الخلايا باستخدام المجهر الفلورسنت لتعقب بدء إشارات ميتة. اعتمادا على ما يجري تصويرها يمكنك الصورة في لوحة متعددة جيدا أو نقل الجل على شريحة المجهر قبل وضعها على المسرح المجهر. ويتم تحقيق الإثارة ذروتها الأحمر التاءات في 556nm والانبعاثات ذروتها في 586nm. الانبعاثات المكثفة إلى حد ما وبالتالي photobleaching لم observإد أن يكون مشكلة. الفارق الزمني بين الشروع في إنتاج البروتين وأول إشارة الكشف عن ما يقرب من 12 ساعة. إشارة محددة بما فيه الكفاية لتحديد الخلايا الفردية إشارات ، ولكن القرار قد لا تكون كافية لتحديد الخلايا توطين الإشارة. في الخلايا مما يشير ، يلاحظ عادة إشارة بشكل موحد في جميع أنحاء السيتوبلازم. ويمكن الإشارة أيضا زيادة كثافة مع التعرض لنقص الأكسجة الموسعة ، على الرغم من أننا حتى الآن لم يحدد تماما ما إذا كان هذا يرجع إلى زيادة البروتين التعبير ، عموما تراكم البروتين ، أو تأخر نضج البروتين. 5. ممثل النتائج ويبين المثال ممثل MIN6 المجاميع مغلفة في هيدروجيل PEG في الشكل 4. فإن جل crosslinked تكون صلبة في جميع أنحاء ، آخذا شكل السفينة التي كان يؤديها في رد الفعل. وهلام مع أسطح سلسة الخارجي هو الأفضل لزرع للمساعدة في منع إعادة جسم غريبsponse. في هلام ، ينبغي المجاميع الخلية المغلقة بالكامل في المصفوفة وتوزيعها متجانس للسماح لنقل المواد الغذائية على نحو أفضل. والصور المصورة ممثل يشير ميتة في MIN6 المجاميع في الشكل 5. وكانت متطابقة مثقف MIN6 المجاميع المصابة بالفيروس في علامة O 20 ٪ إما 2 (5A) أو 1 ٪ O 2 (5B) لمدة 44 ساعة قبل التقاط الصورة. الشكل 1. التخطيطي لنشاط نظامنا علامة نقص الأكسجة. الفيروسة الغدانية الإدراج من الجين التاءات DR الأحمر والمنبع المروج تعليم حقوق الإنسان يسمح لنقص الأكسجة الناجم عن إنتاج بروتين فلوري تحت سيطرة مؤسسة الحرمين – 1. الشكل 2. فرقت الإجرائية الرسم البياني للتغليف خطوة واحدة من الخلايا في MIN6 هيدروosslinked هيدروجيل PEGDM. لكل جيل ، وعلقت الخلايا الموزعة في 40μL من macromer حل PEGDM متفاعل للضوء. يتم وضع هذا في حقنة a 1mL مقطوعة الرأس ، ويتم تشكيل هيدروجيل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية 365nm بعد 10-12 دقيقة. عند الانتهاء ، يتم إزالة القرص هيدروجيل من المحاقن ، وغسلها ووضعها في لوحة متوسطة مملوءة جيدا لحضانة. الشكل 3. الإجرائية الرسم البياني للتغليف المزدوج خطوة من الخلايا MIN6 مجمعة في هيدروجيل PEGDM crosslinked. لكل جيل ، يتم تشكيل لأول مرة نصف هلام الأشعة فوق البنفسجية التي يشابك من 20μL من macromer حل PEGDM متفاعل للضوء لمدة 8 دقائق. وعلقت بعناية MIN6 المجاميع في 20μL إضافية من حل macromer متفاعل للضوء الذي يضاف على الجزء العلوي من هلام نصف قبل تشكيلها. يتم تشكيل هلام الكامل من قبل 8 دقائق من التعرض للأشعة فوق البنفسجية إضافية مع المجاميع مغلفة بشكل كامل في الإنسيالطائرة من هلام. الشكل 4. صورة من هيدروجيل 40μL 20X تحت التكبير. وينظر بشكل واضح MIN6 المجاميع (~ 400000 مجموع الخلايا) داخل هلام. قطرها حوالي 6mm هيدروجيل هو (شريط 1MM =). الشكل 5. نقص الأكسجين في الخلايا مما يشير نيون MIN6 مجمعة في هيدروجيل PEGDM. الخلايا التي تم تغليفها ثم توضع في الحضانة عند 20 ٪ O 2 لمدة 44 ساعة لا تعرض إشارات نقص الأكسجة (أ) في حين أن الخلايا التي تم تغليفها ثم حضنت في 2 ٪ O ​​2 لمدة 44 ساعة شاشة واضحة ، إشارة في كل مكان. (شريط 100μm =) (ب).

Discussion

الطريقة المعروضة هنا تقدم تقنية سريعة وبسيطة لتغليف الخلايا في هيدروجيل الربط مع استخدام الحد الأدنى من الشروط غير الفسيولوجية. PEG يمثل مادة التغليف مفيدة جدا للتوافق مع الحياة وسهولة التعديل. اختلاف بسيط من نسبة الربط في حل متفاعل للضوء ، على سبيل المثال ، قد يتم استخدامها لضبط الخواص الميكانيكية ، مثل معامل الضغط ، وخصائص النقل عن طريق حجم المسام. أيضا ، يتم تعديل الربط بسهولة عن طريق إضافة السلاسل الجانبية. PEG الهلاميات المائية ، وبالتالي ، تمثل كل جهاز السريرية واعدة منصة مرنة للأبحاث في المختبر

كما تم تتبع طريقة لنقص الأكسجة في الربط بين الخلايا مغلفة المقدمة. هذه الطريقة مفيدة للكشف عن نقص الأكسجة بساطة وتجنب الحاجة للتضحية خلايا الفائدة. ويمكن تطبيق هذه التقنية لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا في مجموعة متنوعة من الظروف مما يجعلنا فيefulness اسعة. على سبيل المثال ، قد يتم تعقب نقص الأكسجة وتلميحا عن تمايز الخلايا الجذعية في الثقافات الجذعية micromass الخلية. ومع ذلك ، لا يمكن إلا أن تطبق هذه الطريقة لتفريق نظم الخلية أو النظام الذي يتم تجميعها في وقت لاحق فرقت الخلايا. أيضا ، قد كشف للإشارة الفلورسنت يكون من الصعب في الأنسجة أكبر أو أكثر كثافة.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional
PEG	Sigma-Aldrich	309028-500G
Methacrylic Anhydride	Sigma-Aldrich	276685-100ML
Microwave	Emerson	MW8784SB
Vortexer	Scientific Industries	SI-A236
Methylene Chloride	Sigma-Aldrich	D65100-1L
Diethyl Ether	Sigma-Aldrich	346136-1L
Dialysis Tubing	Spectrum	132640
	Laboratories
Freezer
Lyophilizer	Labconco	7670521
Vacuum pump	Welch	8917Z-01
Irgacure 2959	Ciba-Geigy	029891301PS04
HBSS	Mediatech	21-022-CV
Syringe Filter	VWR	28145-477
RPMI 1640	Mediatech	*	*custom formulation
FBS	PAA Laboratories	A15-351
Penicillin-Streptomycin	Mediatech	30-002-CI
Amphotericin B	Mediatech	30-003-CF
Incubator	Thermo Scientific	3597	Napco Series 8000 WJ w/ O2 suppression
Trypsin EDTA	Mediatech	25-052-CI
Orbital Shaker	VWR	12620-926
UV Lamp	Sanyo Denri	FLR40SBLB/M	Holds two 40W, 365nm blacklight blue UV bulbs
Centrifuge	Eppendorf	5811 000.010*	*order number.  Model 5810 R
Microscope	Nikon	TI-ND6-PFS	With filterset for 556nm excitation/ 586nm emission