तरीकों का एक सेट सीधे आगे के लिए अलग और सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन के कंकाल की मांसपेशी में व्यक्त पहचान निर्धारित है. 800 स्पॉट के बारे में 10 मिलीग्राम मांसपेशियों से एक दो आयामी जेल पर discerned हैं, यह लिंग विशिष्ट प्रोटीन अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए अनुमति देता है. इन विधियों सबसे ऊतकों में बराबर परिणाम दे देंगे.
कंकाल की मांसपेशी में सकल संकुचन मुख्य रूप से सिकुड़ा प्रोटीन की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या के द्वारा निर्धारित किया जाता है, लेकिन इस ऊतक भी उल्लेखनीय प्रतिरोध व्यायाम और अप्रचार द्वारा शोष द्वारा अतिवृद्धि जैसे पर्यावरणीय कारकों एक अनुकूलनीय है. यह इस प्रकार तनाव (गर्मी, ischemia, भारी धातुओं, आदि.) 2,3 करने के लिए remodeling और रूपांतरों को दर्शाती है. मांसपेशियों को नुकसान की मांसपेशियों exerting बल द्वारा होते हैं, जबकि लंबी कर सकते हैं, तथाकथित सनकी संकुचन 4. सिकुड़ा प्रोटीन जैसे exertions में क्षतिग्रस्त हो सकता है और करने के लिए, अपमानित और / या resynthesized मरम्मत की जरूरत है, इन कार्यों सिकुड़ा प्रोटीन का हिस्सा नहीं हैं, लेकिन सेल में अन्य बहुत कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन की. यह निर्धारित करने के लिए क्या प्रोटीन का सबसेट क्षति के इस प्रकार के सुधार में शामिल है, एक वैश्विक proteome पहले स्थापित किया जाना चाहिए करने के लिए 5 व्यायाम और तब व्यायाम के बाद पीछा अंतर निर्धारित करने के लिएप्रोटीन अभिव्यक्ति और जिससे रूपांतरों में नुकसान और इसकी मरम्मत के लिए उम्मीदवार प्रोटीन पर प्रकाश डाला. इसके अलावा, प्रजातियों के नर कंकाल की मांसपेशी के सबसे अधिक अध्ययन आयोजित किया गया है और इसलिए महिला की मांसपेशी के प्रतिनिधि नहीं हो सकता है.
इस अनुच्छेद में हम प्रोटीन reproducibly पुरुष और महिला की मांसपेशियों से निकालने और उन्हें दो आयामी जेल उच्च संकल्प डिजिटल इमेजिंग 6 द्वारा पीछा वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. यह स्पॉट (और बाद में पहचान प्रोटीन) है कि इस शो के लिए एक प्रोटोकॉल है एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण (पी <0.05) दो गुना वृद्धि या कमी दिखाई देते हैं, या नियंत्रण राज्य से गायब है. प्रदान करता है ये तो, excised trypsin के साथ पचा और उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी प्रोटीन (नियंत्रण रेखा / एमएस / एमएस) की पहचान 5 के लिए एक मास स्पेक्ट्रोमीटर (नियंत्रण रेखा / एमएस) के लिए मिलकर द्वारा अलग. इस पद्धति (चित्रा 1) कोई संशोधन के लिए थोड़ा के साथ कई ऊतकों पर इस्तेमाल किया जा सकता है (लीवर, मस्तिष्क, सुनआदि.) टी.
नियंत्रण रेखा / एमएस प्रोटिओमिक्स यहाँ प्रस्तुत विधि कंकाल की मांसपेशी proteome के पहले के स्तर की एक तेजी से विश्लेषण के लिए एक सबसे विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल है. यह लिंग विशिष्टता के एक यथोचित समीचीन तुलना के लिए अनुमति देता है. कम बहुतायत प्रोटीन मांसपेशियों के नमूने के एक fractionation के रूप में संभव के रूप में सिकुड़ा प्रोटीन के कई दूर करने के लिए, जिससे कम बहुतायत प्रोटीन में वृद्धि की आवश्यकता होगी. Proteome प्रोफ़ाइल सिलाई भिन्न पीएच रेंज IPG स्ट्रिप्स और वैकल्पिक प्रतिशत ढाल जैल के साथ पूरा किया जा सकता है अगर वांछित. अधिक संवेदनशील फ्लोरोसेंट दाग मौजूद हैं, लेकिन हम अनुशंसा करते हैं कि प्रत्येक प्रयोगशाला आपके सिस्टम में इन दाग के linearity निर्धारित है. प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक और अधिक कठोर विश्लेषण के लिए DIGE प्रणाली (दो आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन प्रणाली में, जीई हेल्थकेयर लाइफ साइंसेज) में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस पद्धति के लिए जटिलता का एक स्तर जोड़ने करता है. इसके अलावा, इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल सबसे ani के साथ इस्तेमाल किया जा सकता हैमल ऊतकों जिसके लिए एक जीनोम अनुक्रम निर्धारण किया गया है, के रूप में डी किसी भी स्रोत से एक प्रोटीन की नोवो अनुक्रमण के रूप में अच्छी तरह से, के रूप में के रूप में लंबे समय से यह एक दो आयामी जेल पर हल किया जा सकता है, क्योंकि अतिव्यापी एंजाइमी टुकड़े इसके अलावा में उच्च शुद्धता एंजाइमों का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है trypsin करने के लिए. अन्य ऊतकों के स्रोतों से नमूने निष्कर्षण कार्यप्रणाली में कुछ परिवर्तन की आवश्यकता है, झिल्ली और hydrophobic प्रोटीन के लिए देख रहे हैं, खासकर यदि तथापि, हम अच्छे परिणाम हृदय, जिगर, गुर्दे, और मस्तिष्क के ऊतकों के साथ इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है हो सकता है. अन्य बाद translational संशोधनों जन स्पेक्ट्रम डेटाबेस खोज मापदंड को संशोधित करके पता लगाया जा सकता है. संक्षेप में, हम एक हद तक विस्तृत विश्लेषण proteome रूपरेखा के लिए प्रारंभिक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है.
The authors have nothing to disclose.
हम चित्रा 3 का उपयोग करने के लिए Yutian गण मन धन्यवाद. यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन 0420971 द्वारा समर्थित किया गया था, स्मिथ कॉलेज Blakeslee, Wilens और होम्स धन, और हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट.
Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|---|
PepClean C-18 Spin Columns |
Consumable | ThermoFisher Scientific |
PI-89870 | |
Pepswift monolithic column (100um x 5 cm) |
Consumable | Dionex | 162348 | |
Criterion pre-cast 10.5%-14% Tris-HCl SDS polyacrylamide gels |
Consumable | BioRad | 345-0106 | |
Readystrip IPG strips | Consumable | BioRad | Varying pH ranges |
|
Acetic acid | Reagent | Fisher Scientific | A465-1 | |
Acetone | Reagent | Pharmco | 329000 | |
Acetonitrile | Reagent | Fisher Scientific | A955 | |
Agarose | Reagent | BioRad | 163-2111 | Overlay solution |
Ammonium bicarbonate | Reagent | Fluka | 40867 | |
Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | BP114 | |
Bio-Lyte Ampholytes | Reagent | BioRad | Varying pH ranges |
|
CHAPS | Reagent | USB | 13361 | |
Commassie blue R-250 | Reagent | ThermoFisher Scientific |
20278 | |
Dithiothreitol (DTT) | Reagent | USB | 15395 | |
Formic acid | Reagent | ThermoFisher Scientific |
28905 | |
Glycerol | Reagent | Sigma-Aldrich | G6279 | |
Glycine | Reagent | USB | 16407 | |
Iodoacetamide | Reagent | Sigma-Aldrich | I6125 | |
Methanol | Reagent | Fisher Scientific | A452 | |
Mineral oil | Reagent | BioRad | 163-2129 | |
Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | L6026 | |
Tris base | Reagent | Sigma-Aldrich | 93349 | |
Tris[2-carboexyethyl] phosphine |
Reagent | ThermoFisher Scientific |
77720 | |
Trypsin Endoproteinase, TPCK treated, MS grade |
Reagent | Pierce | 90055 | modified |
Urea | Reagent | USB | 75826 | |
Water | Reagent | Burdick& Jackson |
365 | |
Centrivap Concentrator | Tool | Labconco | ||
Exquest spot cutter | Tool | BioRad | ||
LCQ Deca XP Max ion trap mass spectrometer |
Tool | ThermoFisher Scientific |
||
Motorized pestle | Tool | Kontes Corp | ||
Polypropylene stirring | Tool | BioSpec Prod | ||
rods | ||||
PROTEAN IEF cell | Tool | BioRad | ||
Sonicator | Tool | Branson | ||
Surveyor Plus HPLC system |
Tool | ThermoFisher Scientific |
||
VersaDoc imaging system |
Tool | BioRad |