En rett-fram sett av metoder for å isolere og fastslå identiteten til de mest tallrike proteinene uttrykt i skjelettmuskulatur. Omtrent 800 flekker er avdekket, på en to-dimensjonal gel fra 10 mg muskler, og dette gjør det mulig for bestemmelse av kjønnsspesifikke protein uttrykk. Disse metodene vil gi tilsvarende resultater i de fleste vev.
Brutto sammentrekning i skjelettmuskulatur bestemmes i hovedsak av et relativt lite antall kontraktile proteiner, men dette vevet er også bemerkelsesverdig tilpasningsdyktig til miljøfaktorer en som hypertrofi av styrketrening og atrofi av stillstand. Det dermed utstillinger ombygging og tilpasninger til stressors (varme, iskemi, tungmetaller, osv..) 2,3. Skader kan oppstå til muskel ved en muskel utøve kraft mens forlengelse, den såkalte eksentriske sammentrekning fire. Den kontraktile proteiner kan bli skadet i slike anstrengelser og må repareres, degradert og / eller resynthesized; disse funksjonene er ikke en del av kontraktile proteiner, men av andre langt mindre rikelig proteiner i cellen. Å fastslå hva undergruppe av proteiner er involvert i forbedring av denne type skade, må en global proteom være etablert før trening 5 og deretter fulgt etter øvelsen å bestemme differensialprotein uttrykk og dermed fremheve kandidat proteiner i tilpasninger til skaden og dens reparasjon. Videre har de fleste studier av skjelettmuskulatur vært gjennomført på den mannlige av arter og dermed kan ikke være representativt for kvinnelige muskler.
I denne artikkelen presenterer vi en metode for utvinning av proteiner reproduserbart fra mannlige og kvinnelige muskler, og skille dem ved to-dimensjonal gel elektroforese etterfulgt av høyoppløselig digital bildebehandling 6. Dette gir en protokoll for flekker (og senere identifisert proteiner) som viser en statistisk signifikant (p <0,05) to-fold økning eller nedgang, vises eller forsvinner fra kontroll staten. Disse blir deretter excised, fordøyd med trypsin og atskilt av høytrykks-væskekromatografi koblet til et massespektrometer (LC / MS) for protein identifikasjon (LC / MS / MS) 5. Denne metodikken (Figur 1) kan brukes på mange vev med liten eller ingen modifikasjon (lever, hjerne, hørt etc.).
LC / MS proteomikk metoden som presenteres her er en mest pålitelige og reproduserbare protokoll for en rask analyse av det første nivået av skjelettmuskulatur proteomet. Det gir mulighet for en rimelig hensiktsmessig sammenligning av kjønn spesifisitet. Lav overflod proteiner ville kreve en fraksjonering av muskelen prøve å fjerne så mange av de kontraktile proteiner som mulig, og dermed øke den lave overflod proteiner. Skreddersy proteomet profilen kan oppnås med ulik pH-område IPG striper og alternativ prosentvis stigning gels hvis ønskelig. Mer sensitive fluorescerende flekker eksisterer, men vi anbefaler at hvert laboratorium bestemmer lineariteten av disse flekkene i systemet. For en mer grundig analyse av protein uttrykket Dige system (to-Dimensional In-Gel elektroforese system, GE Healthcare og biovitenskap) kan brukes, men dette legger et nivå av kompleksitet til metodikk. Videre kan protokollen her beskrevet brukes med de fleste animal vev som et genom er sekvensert, samt de novo sekvensering av et protein fra en kilde, så lenge det kan løses på en to-dimensjonal gel, siden overlappende enzymatisk fragmentene kan være generert ved hjelp av høy renhet enzymer i tillegg til trypsin. Prøver fra andre vev kilder kan kreve noen endringer i utvinning metodikk, særlig hvis leter etter membran og hydrofobe proteiner, har vi imidlertid hatt gode resultater ved hjelp av denne protokollen med hjerte, lever, nyre og hjerne vev. Andre posttranslasjonelle modifikasjoner kan oppdages ved å endre massen spekteret databasen søkekriterier. I sum har vi presentert et rimelig detaljert første protokollen for proteom profilering analyse.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Yutian Gan for bruk av figur 3. Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation 0420971, Smith College Blakeslee, Wilens og Holmes midler, og Howard Hughes Medical Institute.
Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|---|
PepClean C-18 Spin Columns |
Consumable | ThermoFisher Scientific |
PI-89870 | |
Pepswift monolithic column (100um x 5 cm) |
Consumable | Dionex | 162348 | |
Criterion pre-cast 10.5%-14% Tris-HCl SDS polyacrylamide gels |
Consumable | BioRad | 345-0106 | |
Readystrip IPG strips | Consumable | BioRad | Varying pH ranges |
|
Acetic acid | Reagent | Fisher Scientific | A465-1 | |
Acetone | Reagent | Pharmco | 329000 | |
Acetonitrile | Reagent | Fisher Scientific | A955 | |
Agarose | Reagent | BioRad | 163-2111 | Overlay solution |
Ammonium bicarbonate | Reagent | Fluka | 40867 | |
Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | BP114 | |
Bio-Lyte Ampholytes | Reagent | BioRad | Varying pH ranges |
|
CHAPS | Reagent | USB | 13361 | |
Commassie blue R-250 | Reagent | ThermoFisher Scientific |
20278 | |
Dithiothreitol (DTT) | Reagent | USB | 15395 | |
Formic acid | Reagent | ThermoFisher Scientific |
28905 | |
Glycerol | Reagent | Sigma-Aldrich | G6279 | |
Glycine | Reagent | USB | 16407 | |
Iodoacetamide | Reagent | Sigma-Aldrich | I6125 | |
Methanol | Reagent | Fisher Scientific | A452 | |
Mineral oil | Reagent | BioRad | 163-2129 | |
Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | L6026 | |
Tris base | Reagent | Sigma-Aldrich | 93349 | |
Tris[2-carboexyethyl] phosphine |
Reagent | ThermoFisher Scientific |
77720 | |
Trypsin Endoproteinase, TPCK treated, MS grade |
Reagent | Pierce | 90055 | modified |
Urea | Reagent | USB | 75826 | |
Water | Reagent | Burdick& Jackson |
365 | |
Centrivap Concentrator | Tool | Labconco | ||
Exquest spot cutter | Tool | BioRad | ||
LCQ Deca XP Max ion trap mass spectrometer |
Tool | ThermoFisher Scientific |
||
Motorized pestle | Tool | Kontes Corp | ||
Polypropylene stirring | Tool | BioSpec Prod | ||
rods | ||||
PROTEAN IEF cell | Tool | BioRad | ||
Sonicator | Tool | Branson | ||
Surveyor Plus HPLC system |
Tool | ThermoFisher Scientific |
||
VersaDoc imaging system |
Tool | BioRad |