마우스 폐 돌기 세포의 고도 정화 준비가 설명되어 있습니다. 구체적인 중점이 종래의 돌기 세포 집합의 고립에 제공됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
폐암 돌기 세포 (DC)는 호흡기 tolerogenic 응답의 제어뿐만 아니라 3 침입 병원균 1,2를 감지의 근본적인 역할을한다. 폐암 돌기 세포 중 적어도 세 가지 주요 하위 집합은 생쥐에서 설명되었습니다 : 종래의 DC (CDC) 4, plasmacytoid DC (PDC) 5 IFN 생산 킬러 DC (IKDC) 6,7. CDC 집합은 폐 8 가장 유명한 DC의 하위 집합입니다.
DC의 하위 집합을 식별하는 것으로 알려진 일반적인 마커는 CD11c, 유형 I 또한, monocytes, macrophages, neutrophils 및 일부 B 세포 9 표현 transmembrane 인테 그린 (β2)입니다. 일부 조직에서는, 마우스 DC를 식별하는 마커로 CD11c를 사용하면 대부분의 CD11c + 세포가 주요 histocompatibility 복잡한 클래스 II (MHC - II)의 높은 수준을 표현 CDC의 하위 집합을 나타냅니다 비장에 같은 유효합니다. 그러나, 폐는 더 이질적인 조직입니다사이드 DC의 하위 집합은 MHC - II의 낮은 수준의 한판 승부 CD11c 높은 수준을 표현 뚜렷한 세포 인구의 높은 비율 있습니다. 의 특성과 대부분 F4/80, 지라 대식 세포 표지 자사의 표현에 따르면, CD11c 하이 MHC - II 그런 건 폐 전지 인구가 잠재적인 DC 전구체 11로, 폐동맥 macrophages 최근 10으로 확인되었습니다.
마우스 PDC 대조적으로, 폐의 면역 반응에 CDC의 특정 역할의 연구는 이러한 세포의 격리에 도움이 될 특정 마커의 부족으로 인해 제한되었습니다. 따라서,이 작품에서 우리는 고도로 정제된 마우스 폐 질병을 분리하는 절차를 설명합니다. 폐 DC의 하위 집합의 분리는 호흡기 병원균뿐만 아니라 폐의 호스트 면역 반응을 일으킬 수있다 환경 요인에 대한 응답에서 이러한 세포의 기능에 대한 통찰력을 얻기 위해 매우 유용한 도구를 나타냅니다.
프로토콜
1. 폐 재관류 및 단일 세포 현탁액
- 대퇴 정맥을 통해 intraperitoneal 케타민을 / xylazine 마취 혼합물의 주입 (MG / 마우스 케타민을 1.8, xylazine 0.19) 및 과다와 마우스를 안락사
- 절단하고 부드럽게 복막의 바깥쪽 피부를 다시 당겨 흉강을 폭로. 심장과 폐 모두 노출 갈빗대 절단하여 다이어프램을 열 진행합니다.
- EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - HBSS (칼슘 / 마그네슘없는 HBSS에 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))로 가득 5 ML의 주사기를 사용하여 부드럽게 폐가 Perfuse. 25 G 바늘을 연결하고 우심실에 바늘을 삽입합니다. 주사하는 동안 누출을 방지하기 위해, 집게를 사용하여 바늘 주위 myocardiac 조직을 확보. 상수 압력을 유지하면서 부드럽게 솔루션을 주입. 정확한 재관류는 폐암의 인플레이션과 분홍색 / 흰색 색상의 변화가 발생합니다.
- 이 조직에서 잠재적인 오염을 폐기하기 위해 림프절을 배수 제거합니다.
- 수집폐 조직은 얼음에 페트리 접시에 전송하고, 면도날을 사용하여 작은 조각으로 썰어.
- 5 ML / collagenase의 소화 솔루션의 폐를 포함하는 gentleMACS C 관에 근거 조직을....
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토론
폐 마우스 DC의 격리가 호흡기 자극의 다양한 연구를위한 중요한 기술이다. 이러한 세포를 얻는 과정은 세포의 손실뿐만 아니라 세포 생존과 정결을 방지 중요한 단계를 포함하고 있습니다. 수령 전에 폐가 Perfusing 것은 물론 오염 물질을 감소 적혈구와 같은 주변 세포를 제거하는 데 도움이 될 것입니다. 폐 다수의 처리 때 자동 분리의 사용 advanteogus 수있다 그렇지 않으면 수동으로 완료되면 collagenase는 소화 후 조직의 분산이 부드럽게 수행되어야한다는 것을 염두에 유지, 대체 프로토콜을 선택할 수 있습니다. 폐 조직의 잠복기는 collagenase 솔루션 동안 지정된 부화 시간 이상 연장해서는 안됩니다. 이 단계 후에, 나머지 과정은 세포 사망을 줄이기 위해 얼음처럼 차가운 버퍼 및 냉장 원심 분리기를 사용하여 수행할 수 있어야합니다. 오염 적혈구의 용해 더 t 반복하지 말았어야 할 단계입니다두 번 한 전체 과정. 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 통과, 지정된 단계에서 세포 분류기의 막히는뿐만 아니라 세.......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
저자 microphotographs 그의 도움을 셀 정렬과 피터 Mottram 함께 그녀의 도움 LSU의 유동세포계측법 코어 시설에서 마릴린 디트리히에 감사드립니다. 이 작품은 비행 수행자 의학 연구소, LSU 경쟁력 연구 프로그램 수상, 그리고 NIH / NIAID 기금 P20 RR020159 및 R03AI081171에 의해 후원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 (옵션) |
| ACK lysing 버퍼 | Invitrogen | D6 - 0005DG | |
| 안티 마우스 CD11c (HL3) | BD Pharmingen | 5,580,979 | PE - Cy7 복합 |
| 안티 마우스 IA / IE (269) | BD - Pharmingen | 553,623 | 복합 FITC |
| Collangenase 입력 1A | 시그마 | 9891 - 500MG | |
| 세포 strainers | BD 팔콘 | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi | 130-052-001 | |
| DNase I | 시그마 | D5025 - 150KU | |
| 행크의 균형 소금 솔루션 | Invitrogen | 14,170 | |
| Hepes 버퍼 솔루션 | Invitrogen | 15,630 | |
| 배양 접시 60mm | BD 팔콘 | 351,016 | |
| GentleMACS ™ C 튜브 | Miltenyi | 130-093-237 | |
| 젠틀 맥에서의 dissociator | Miltentyi | 130-093-235 | |
| AutoMACS - PRO ™ | Miltenyi | 130-092-545 | |
| FASCS 아리아 | BD |
참고문헌
- Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. Sensing pathogens and tuning immune responses. Science. 293, 253-256 (2001).
- Banchereau, J. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Manicassamy, S., Pulendran, B.
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재인쇄 및 허가
