قياس إزفاء الببتيد في الحويصلات الكبيرة Unilamellar
Summary
تفاصيل هذا البروتوكول طريقة لقياس كمية كبيرة إزفاء الببتيد في الحويصلات unilamellar الدهون. هذا الأسلوب يوفر أيضا معلومات حول معدل إزفاء الغشاء ، ويمكن استخدامها لتحديد الببتيدات التي بكفاءة وبشكل عفوي عبر طبقات ثنائية الدهون.
Abstract
هناك اهتمام فعلي في الببتيدات التي عبر أغشية الخلايا بسهولة دون مساعدة من مستقبلات غشاء الخلية 1. ويشار إلى أن العديد من هذه الخلايا واختراق الببتيدات ، والتي كثيرا ما لاحظت لإمكاناتهم وناقلات تسليم المخدرات 1-3. وعلاوة على ذلك ، هناك اهتمام متزايد في الببتيدات المضادة للجراثيم التي تعمل عبر آليات غير غشاء lytic 4،5 ، ولا سيما تلك التي تعبر الأغشية الجرثومي دون أن تسبب تحلل الخلايا وتقتل الخلايا عن طريق التدخل في العمليات داخل الخلايا 6،7. في الواقع ، لقد أشار الكتاب على نحو متزايد إلى العلاقة بين الخلية الببتيدات المضادة للميكروبات واختراق 1،8. الفهم الراسخ لعملية إزفاء الغشاء ، والعلاقة بين هيكل الببتيد وقدرتها على نقل من مكان لآخر يتطلب فعالة ، لإزفاء المقايسات استنساخه. وقد اقترحت عدة مجموعات أساليب لقياس إزفاء في unilamel كبيرةحويصلات الدهنية لار (LUVs) 9-13. LUVs بمثابة نماذج مفيدة لأغشية الخلايا البكتيرية وحقيقية النواة ، وكثيرا ما تستخدم في الدراسات الفلورية الببتيد 14،15. هنا ، ونحن طلبنا من وصف الطريقة التي وضعت في بادئ ماتسوزاكي وزملاء العمل للنظر في الببتيدات المضادة للجراثيم ، مثل magainin buforin والثاني 16،17. بالإضافة إلى توفير بروتوكول لدينا لهذا الأسلوب ، فإننا نقدم أيضا مقاربة مباشرة لتحليل البيانات التي الكمي قدرة إزفاء باستخدام هذا الاختبار. مزايا هذا الاختبار إزفاء بالمقارنة مع الآخرين هي أنه لديه القدرة على تقديم معلومات حول معدل إزفاء غشاء ولا تتطلب إضافة تسمية فلوري ، الذي يمكن أن يغير خصائص الببتيد 18 ، لالتربتوفان التي تحتوي على الببتيدات. لفترة وجيزة ، يتم قياس قدرة إزفاء في الحويصلات الدهون بوصفها وظيفة من طاقة نقل الرنين فوستر (الحنق) بين الأم ومخلفات التربتوفان دansyl فسفاتيديل إيثانولامين عندما ترتبط مع بروتينات الغشاء الخارجي LUV (الشكل 1). والمشقوق اختراق الخلية والببتيدات التي يواجهونها التربسين يحتاطون مغلفة مع LUVs ، مما أدى إلى disassociation من غشاء LUV وانخفاضا في إشارة الحنق. انخفاض الحنق لاحظ إشارة الببتيد translocating أكبر بكثير من تلك التي لوحظت في نفس الببتيد عندما LUVs تحتوي على كل ومثبط التربسين التربسين ، أو عندما يتعرض الببتيد الذي لا يعبر بشكل عفوي الأغشية الدهنية المحتوية على التربسين LUVs. هذا التغيير في مضان يوفر الكمي المباشر لإزفاء الببتيد مع مرور الوقت.
Protocol
Discussion
ويمكن استخدام بروتوكول المعروضة هنا لتقييم التغير النسبي في تركيز الببتيد داخل وخارج حويصلات الدهنية. وترتبط هذه التغييرات القدرة إزفاء. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد الخلايا اختراق الببتيدات مع إمكانات وناقلات تسليم المخدرات. كما مصلحة في اختراق الخلية الب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر اليانور فليمينغ وتشن جيسيكا لإجراء مناقشات مفيدة. تم توفير التمويل من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIH – NIAID) جائزة R15AI079685 ومؤسسة البحوث كلية العلوم جائزة كوتريل. وقدمت دعما إضافيا من الطلاب من معهد هوارد هيوز الطبي وصندوق ستالي.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 16:0-18:1 PG | Avanti Polar Lipids | 840457C |
| 1:18 Dansyl PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| 16:0-18:1 PC | Avanti Polar Lipids | 850457C |
| Porcine trypsin | Sigma | T-0303 |
| Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor | Sigma | T-9777 |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 |
| Ammonium molybdate (para) | Alfa Aesar | 10811 |
| L-ascorbic acid | Sigma | A1417 |
| Hydrogen Peroxide, 30% solution | Mallinckrodt chemicals | 5240-05 |
| HEPES | Sigma | H-3375 |
| NaCl | Sigma | S-9625 |
| EDTA | Sigma | E5134 |
| NaH2PO4 | Sigma | S-0751 |
References
- Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they?. Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).
- Trehin, R., Merkle, H. P. Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 209-209 (2004).
- Temsamani, J., Vidal, P. The use of cell-penetrating peptides for drug delivery. Drug Discov. Today. 9 (23), 1012-1012 (2004).
- Hale, J. D., Hancock, R. E. Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 5 (6), 951-951 (2007).
- Nicolas, P., Rosenstein, Y. Multifunctional host defense peptides. FEBS J. 276 (22), 6464-6464 (2009).
- Boman, H. G., Agerberth, B., Boman, A. Mechanisms of Action on Escherichia-Coli of Cecropin-P1 and Pr-39, 2 Antibacterial Peptides from Pig Intestine. Infection and Immunity. 61 (7), 2978-2978 (1993).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 244 (1), 253-253 (1998).
- Bobone, S. The thin line between cell-penetrating and antimicrobial peptides: the case of Pep-1 and Pep-1-K. J. Pept. Sci. 17 (5), 335-335 (2011).
- Marks, J. R., Placone, J., Hristova, K., Wimley, W. C. Spontaneous Membrane-Translocating Peptides by Orthogonal High-throughput Screening. J. Am. Chem. Soc.. , (2011).
- Rosenbluh, J. Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes. J. Mol. Biol. 345 (2), 387-387 (2005).
- Bárány-Wallje, E. A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes. Biophys. J. 89 (4), 2513-2513 (2005).
- Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Translocation of beta-galactosidase mediated by the cell-penetrating peptide pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential. 생화학. 44 (30), 10189-10189 (2005).
- Orioni, B. Membrane perturbation by the antimicrobial peptide PMAP-23: a fluorescence and molecular dynamics study. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (7), 1523-1523 (2009).
- Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S., White, S. H. How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother?. Anal. Biochem. 285 (2), 235-235 (2000).
- Epand, R. M., Epand, R. F. Liposomes as models for antimicrobial peptides. Methods Enzymol. 372, 124-124 (2003).
- Kobayashi, S. Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: Proline as a translocation promoting factor. 생화학. 39 (29), 8648-8648 (2000).
- Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., Miyajima, K. Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore. 생화학. 34 (19), 6521-6521 (1995).
- Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1. FEBS Lett. 579 (20), 4498-4498 (2005).
- Torchilin, V. P., Weissig, V. . Liposomes. , (2003).
- Almeida, P. F., Pokorny, A. Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus. 생화학. 1686 (34), 8083-8083 (2009).
- Kobayashi, S. Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. 생화학. 43 (49), 15610-15610 (2004).
