Количественный анализ случайных миграции клеток помощью замедленной видео микроскопии
Summary
Этот метод позволяет осуществлять мониторинг клеток в реальном времени и количественных измерений различных параметров миграции клеток, таких как скорость, перемещение и скорость. В отличие от традиционных методов, это реальный подход время не на основе конечных количественных измерений миграции, вместо этого она позволяет осуществлять мониторинг и расчет различных параметров непрерывно.
Abstract
Сотовые миграция представляет собой динамический процесс, который имеет важное значение для эмбрионального развития, восстановления тканей, иммунной системы, а также опухолевой инвазии 1, 2. В направленной миграции клеток быстро двигаться в ответ на внеклеточный сигнал хемотаксиса, или в ответ на внутренние сигналы 3 предоставляемых базовых механизмов подвижности. Случайные миграция происходит, когда клетка обладает низкой внутренней направленности, что позволяет клеткам, чтобы исследовать их местным условиям.
Сотовые миграция представляет собой сложный процесс, в начальной клеточной реакции происходят поляризация и продолжается выступы в направлении миграции 2. Традиционные методы измерения миграции, таких как миграция анализа Бойден камеры простой способ измерения хемотаксис в пробирке, который позволяет измерить миграцию как результат конечной точки. Однако, этот подход позволяет ни измерения отдельных параметров миграции, а также не позволит видеотехникакристаллизации морфологические изменения, которые клетка претерпевает в процессе миграции.
Здесь мы представляем метод, который позволяет нам отслеживать миграцию клеток в реальном времени с помощью видео – микроскопия промежуток времени. Поскольку миграция клеток и вторжения являются признаками рака, этот метод будет применяться в изучении рака миграции клеток и вторжение в пробирке. Случайные миграции тромбоцитов была рассматриваться в качестве одного из параметров тромбоцитов 4 функция, следовательно, этот метод также может быть полезно в изучении функции тромбоцитов. Этот тест имеет то преимущество, что быстрые, надежные, воспроизводимые и не требует оптимизации числа клеток. В целях сохранения физиологически благоприятные условия для клетки, микроскоп снабжен CO 2 и температуры подачи термостата. Сотовые движение контролируется фотосъемки с помощью камеры устанавливается на микроскоп на регулярной основе. Сотовые миграция может быть вычислена путем измерения средней скорости иverage перемещения, который рассчитывается путем программного Slidebook.
Protocol
Discussion
В режиме реального времени случайного анализа миграции позволяет точно, чувствительный, анализ миграции клеток такие параметры, как скорость и перемещение. Этот метод не ограничивается до конца значение точки измерения, следовательно, количественные. Так, клетки контролируется в нор?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Amanda Struckhoff для начальной помощь в проведении эксперимента. Эта работа была поддержана грантом от NIH 5RO1CA115706.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | |
| FBS | Gemini Bio- Products | 100-106 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985-070 | |
| Collagen | BD | 354231 | |
| Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller | Olympus | Olympus 1X81 | |
| Environmental control chamber | Neue | Neue Live Cell Chamber | Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments. |
| Automated XY stage | Prior | Prior Proscan | This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy. |
| Camera | Hamamatsu EM camera C9100 | ||
| Software | Typically purchased through microscope vendor such as Olympus | Slide Book 5 |
References
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84, 359-369 (1996).
- Ridley, A. J. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302, 1704-1709 (2003).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Valone, F. H., Austen, K. F., Goetzl, E. J. Modulation of the random migration of human platelets. J. Clin. Invest. 54, 1100-1106 (1974).
- Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microsc. Res. Tech. 74, 539-545 (2011).
- Struckhoff, A. P. Dynamic regulation of ROCK in tumor cells controls CXCR4-driven adhesion events. J. Cell. Sci. 123, 401-412 (2010).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophoton. Internat. 11, 36-42 (2004).
- Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Tyl Hewitt, A. Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration. Dev. Biol. 87, 259-266 (1981).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nat. Rev. Cancer. 7, 139-147 (2007).
- Yu, Y. P., Luo, J. H. Myopodin-mediated suppression of prostate cancer cell migration involves interaction with zyxin. Cancer. Res. 66, 7414-7419 (2006).
- Teng, T. S., Lin, B., Manser, E., Ng, D. C., Cao, X. Stat3 promotes directional cell migration by regulating Rac1 activity via its activator betaPIX. J. Cell. Sci. 122, 4150-4159 (2009).
- Wozniak, M. A., Kwong, L., Chodniewicz, D., Klemke, R. L., Keely, P. J. R-Ras controls membrane protrusion and cell migration through the spatial regulation of Rac and Rho. Mol. Biol. Cell. 16, 84-96 (2005).
- Orr, A. W., Elzie, C. A., Kucik, D. F., Murphy-Ullrich, J. E. Thrombospondin signaling through the calreticulin/LDL receptor-related protein co-complex stimulates random and directed cell migration. J. Cell Sci. 116, 2917-2927 (2003).
- Smith, A., Bracke, M., Leitinger, B., Porter, J. C., Hogg, N. LFA-1-induced T cell migration on ICAM-1 involves regulation of MLCK-mediated attachment and ROCK-dependent detachment. J. Cell Sci. 116, 3123-3133 (2003).
