Analisi quantitativa della migrazione casuale di celle usando Time-lapse Microscopia Video
Summary
Questo metodo permette di monitoraggio delle cellule in tempo reale e misurazioni quantitative dei diversi parametri di migrazione cellulare, quali la velocità, spostamento e velocità. A differenza dei metodi tradizionali, questo approccio in tempo reale non si basa su misurazioni quantitative di migrazione degli endpoint, invece permette di monitorare e calcolare diversi parametri in modo continuo.
Abstract
La migrazione delle cellule è un processo dinamico, che è importante per lo sviluppo embrionale, la riparazione dei tessuti, la funzione del sistema immunitario, e l'invasione tumorale 1, 2. Durante la migrazione direzionale, cellule muoversi rapidamente in risposta ad un segnale extracellulare chemiotattica, o in risposta a stimoli intrinseci 3 forniti dalla macchina motilità di base. Migrazione casuale si verifica quando una cellula possiede bassa direzionalità intrinseca, permettendo alle cellule di esplorare il loro ambiente locale.
La migrazione cellulare è un processo complesso, nella cella risposta iniziale subisce polarizzazione e sporgenze si estende nella direzione di migrazione 2. I metodi tradizionali per misurare la migrazione quale il saggio Boyden camera di migrazione è un metodo semplice per misurare chemiotassi in vitro, che consente di misurare la migrazione come risultato punto finale. Tuttavia, questo approccio non permette la misurazione di parametri di migrazione singoli, né permette di Visuazazione dei cambiamenti morfologici delle cellule subisce durante la migrazione.
Qui vi presentiamo un metodo che ci permette di monitorare le cellule che migrano in tempo reale con video – microscopia lasso di tempo. Poiché la migrazione cellulare e dell'invasione sono le caratteristiche di cancro, questo metodo è applicabile a studiare la migrazione delle cellule del cancro e l'invasione in vitro. Migrazione casuale di piastrine è stato considerato come uno dei parametri di funzionalità piastrinica 4, quindi questo metodo potrebbe anche essere utile nello studio funzioni piastriniche. Questo saggio ha il vantaggio di essere rapida, affidabile, riproducibile, e non richiede l'ottimizzazione del numero di cellule. Al fine di mantenere condizioni fisiologicamente adatte cellule, il microscopio è dotato di CO 2 di alimentazione e termostato. Movimento cellulare viene monitorata da ripresa di immagini con una telecamera montata sul microscopio a intervalli regolari. La migrazione cellulare può essere calcolata misurando la velocità media eMEDIO spostamento, che viene calcolato dal software Slidebook.
Protocol
Discussion
Il vero test di migrazione tempo casuale consente di preciso, sensibile, l'analisi dei parametri di migrazione delle cellule come la velocità e spostamento. Questo metodo non è limitato alla fine misura valore punto, quindi è più quantitativa. Dal momento che, le cellule vengono monitorati nel normale terreno DMEM con siero, ma riduce l'effetto deleterio di incubazione più lungo nel siero dei media liberi. È stato dimostrato che la migrazione delle cellule dipende dalla formattazione e rottura delle cellul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Amanda Struckhoff per l'aiuto iniziale con l'esperimento. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio NIH 5RO1CA115706.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | |
| FBS | Gemini Bio- Products | 100-106 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985-070 | |
| Collagen | BD | 354231 | |
| Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller | Olympus | Olympus 1X81 | |
| Environmental control chamber | Neue | Neue Live Cell Chamber | Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments. |
| Automated XY stage | Prior | Prior Proscan | This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy. |
| Camera | Hamamatsu EM camera C9100 | ||
| Software | Typically purchased through microscope vendor such as Olympus | Slide Book 5 |
References
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