Et 3D-system med dyrkning menneskelige artikulær chondrocytter i høje niveauer af synovialvæsken er beskrevet. Synovialvæske afspejler den mest naturlige mikromiljø for ledbrusken, og kan let udtages og opbevares. Dette system kan derfor bruges til at studere brusk regenerering og til screening af lægemidler til behandling af gigt.
Bruskdestruktionen er et centralt patologisk træk ved slidgigt, en førende årsag til invaliditet i USA. Brusk i den voksne ikke regenerere meget effektivt in vivo, og som et resultat, fører slidgigt til uoprettelige brusk tab og er ledsaget af kroniske smerter og immobilitet 1,2. Brusk tissue engineering tilbyder lovende potentiale til at regenerere og genoprette væv funktion. Denne teknologi involverer typisk såning chondrocytter i naturlige eller syntetiske stilladser og dyrkning den resulterende 3D konstruere på en afbalanceret medium over en periode på tiden med et mål om Engineering A biokemisk og biomekanisk modne væv, der kan transplanteres ind i en defekt websted in vivo 3-6 . At opnå en optimal betingelse for chondrocytter vækst og matrix deposition er afgørende for succesen af brusk tissue engineering.
I den indfødte fælles hulrum, brusken på Articular overfladen af knoglen er badet i synovialvæske. Denne klare og tyktflydende væske giver næringsstoffer til avascular ledbrusken og indeholder vækstfaktorer, cytokiner og enzymer, der er vigtige for chondrocytter stofskifte 7,8. Desuden synovialvæske letter lav friktion bevægelse mellem bruskspidserne overflader hovedsagelig gennem secernerende to centrale komponenter, hyaluronan og lubricin 9 10. I modsætning hertil er manipuleret væv brusk oftest dyrket i kunstige medier. Mens disse medier er sandsynligvis i stand til at yde mere definerede betingelser for at studere chondrocytter metabolisme, synovialvæske mest præcist afspejler den naturlige miljø, som artikulær chondrocytter bor i.
Faktisk synovialvæske har den fordel af at være let at indhente og opbevare, og kan ofte regelmæssigt fornys af kroppen. Flere grupper har suppleret dyrkningsmediet med ledvæske i voksende menneskelige, kvæg, kaniner og hunde chondrocytes, men mest bruges kun lave niveauer af synovialvæske (under 20%) 25/11. Mens kylling, hest og menneske chondrocytter har været dyrket i medium med højere procentdel af synovialvæske, disse kultur systemer var to-dimensionelle 26-28. Her kan vi præsentere vores metode til dyrkning menneskelige artikulær chondrocytter i et 3D-system med en høj procentdel af synovialvæske (op til 100%) over en periode på 21 dage. Dermed overvandt vi en stor forhindring forelagt af høj viskositet synovialvæsken. Dette system giver mulighed for at studere menneskets chondrocytter i synovialvæske i et 3D-indstilling, som kan yderligere kombineres med to andre vigtige faktorer (oxygenspændingen og mekaniske belastning) 29,30, som udgør det naturlige miljø for brusk til at efterligne det naturlige miljø for brusk vækst. Desuden kan dette system også anvendes til analysering synovialvæske aktivitet på chondrocytter og skabe en platform for udviklingbrusk regeneration teknologier og terapeutiske muligheder for gigt.
I denne rapport har vi udviklet en metode, der giver mulighed for dyrkning af humane artikulær chondrocytter i et 3D-miljø i medium, der indeholder høje koncentrationer af menneskelig synovialvæske. Synovialvæsken er en af de vigtigste komponenter, der udgør det naturlige miljø i den fælles hulrum, hvor artikulær chondrocytter bor. Har imidlertid viskositet synovialvæsken været en stor udfordring for tre-dimensionelle langsigtet dyrkning af chondrocytter. For at overvinde den udfordring at fastholde sel…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Robin Nye (Tufts Medical Center), Tomoya Uchimura og Dana Cairns (Tufts University) for at yde hjælp til synovialvæske opbevaring og centrifugering. Dette arbejde blev finansieret af NIH (1R01AR059106-01A1) til LZ
Table of specific reagents and equipment:
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Alginate (Alginic Acid sodium salt) | Sigma | A2158-250G | 2.4% solution stored at 40°C |
Calcium Chloride Dihydrate, Granular | J.T. Baker | A19339 | |
Chondrogenic Growth media | Lonza | CC-3156 (base media) | |
CC-4409 (supplement) | |||
Chondrogenic Differentiation Media | Lonza | CC-3226 (base media) | |
CC-4408 (supplement) | |||
Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 | |
Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
RNeasy mini kit (for RNA extraction) | Qiagen | 74104 | |
PCR reagents: SYBR-green | Quanta | 95053-500 | |
12 ml syringe | Tyco-Kendall-Monoject | 512852 | |
22-Gague Hypodermic Needle | Tyco-Kendall-Monoject | 8881 | |
Microscope | Olympus | IX71 | |
Platform rocker | Thermoscientific thermolyne | Vari-mix | |
Primers sequences | |||
Collagen IIa-forward | 5′-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3′ | ||
Collagen IIa-reverse | 5′-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3′ | ||
MMP13-forward | 5′-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3′ | ||
MMP13-reverse | 5′-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3′ | ||
Caspase 3-forward | 5′-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3′ | ||
Caspase 3-reverse | 5′-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3′ |