Ein 3D-System für Züchtung menschlichen Chondrozyten in der Synovialflüssigkeit
Summary
Ein 3D-System zur Kultivierung menschlichen Chondrozyten in ein hohes Maß an Gelenkflüssigkeit beschrieben. Synovialflüssigkeit spiegelt den natürlichen Mikroumgebung für Gelenkknorpel, und kann leicht erreicht werden und gespeichert werden. Dieses System kann daher für die Untersuchung Knorpelregeneration und zum Screening von Therapeutika zur Behandlung von Arthritis verwendet werden.
Abstract
Knorpelabbau ist ein zentrales pathologisches Merkmal der Arthrose, eine führende Ursache von Behinderungen in den USA. Knorpel in den Erwachsenen nicht sehr effizient regenerieren in vivo, und als Ergebnis führt Arthrose, Knorpel Verlust irreversibel und wird von chronischen Schmerzen und Unbeweglichkeit 1,2 begleitet. Cartilage Tissue Engineering bietet vielversprechende Möglichkeiten, sich zu regenerieren und wiederherstellen Gewebe-Funktion. Diese Technologie umfasst in der Regel Aussaat Chondrozyten in natürlichen oder synthetischen Gerüsten und Kultivieren der resultierenden 3D in einem ausgewogenen Medium bauen über einen Zeitraum von Zeit, mit dem Ziel der Technik ein biochemisch und biomechanisch ausgereifte Gewebe, das in eine Fehlstelle in vivo 3-6 können transplantiert werden . Das Erreichen einer optimalen Voraussetzung für Wachstum und Chondrozyten-Matrix Ablagerung ist für den Erfolg von Knorpel Tissue Engineering unverzichtbar.
In der nativen Gelenkspalt, Knorpel an der articdere Oberfläche des Knochens ist in Gelenkflüssigkeit gebadet. Diese klare und viskose Flüssigkeit liefert Nährstoffe an die avaskuläre Gelenkknorpel und enthält Wachstumsfaktoren, Zytokine und Enzyme, die wichtig sind für Chondrozytenmetabolismus 7,8. Darüber hinaus erleichtert Synovialflüssigkeit reibungsarme Bewegung zwischen knorpeligen Oberflächen hauptsächlich durch Sekretion zwei Hauptkomponenten, Hyaluronsäure und lubricin 9 10. Im Gegensatz dazu ist Gewebezüchtung Knorpel meist in künstlichen Medien kultiviert. Während dieser Medien eher in der Lage sind, mehr definierten Bedingungen für das Studium Chondrozytenmetabolismus bieten, Synovialflüssigkeit am besten reflektiert die natürliche Umwelt, von denen Chondrozyten wohnen in.
In der Tat hat Synovialflüssigkeit den Vorteil, leicht zu beschaffen und zu speichern, und können oft regelmäßig durch den Körper wieder aufgefüllt werden. Mehrere Gruppen haben das Kulturmedium mit Gelenkflüssigkeit ergänzt wachsende Mensch, Rind, Kaninchen und Hund chondrocytes, aber meist nur geringe Mengen von Gelenkflüssigkeit (unter 20%) 11-25 verwendet. Während Huhn, Pferd und Mensch Chondrozyten in das Medium mit höherer Prozentsatz der Gelenkflüssigkeit gezüchtet haben, wurden diese Kultur Systemen zweidimensionalen 26-28. Hier präsentieren wir unsere Methode der Züchtung menschlichen Chondrozyten in ein 3D-System mit einem hohen Anteil von Gelenkflüssigkeit (bis zu 100%) über einen Zeitraum von 21 Tagen. Dabei überwanden wir eine große Hürde durch die hohe Viskosität der Gelenkflüssigkeit vor. Dieses System bietet die Möglichkeit des Studiums humanen Chondrozyten in Synovialflüssigkeit in einer 3D-Umgebung, die weiter mit zwei weiteren wichtigen Faktoren (Sauerstoff-Partialdruck und mechanischer Belastung) 29,30, dass die natürliche Umwelt darstellen für Knorpel, die natürliche Milieu für imitieren können kombiniert werden Knorpel Wachstum. Darüber hinaus kann dieses System auch für die Bestimmung von Gelenkflüssigkeit Aktivität auf Chondrozyten verwendet werden und bieten eine Plattform für die EntwicklungKnorpelregeneration Technologien und therapeutische Optionen für Arthritis.
Protocol
Discussion
In diesem Bericht haben wir eine Methode, die für die Kultivierung humaner Chondrozyten ermöglicht in einer 3D-Umgebung in Medium, das hohe Konzentrationen von menschlichen Gelenkflüssigkeit enthält. Synovialflüssigkeit ist eine der wichtigsten Komponenten, die die natürliche Umwelt darstellen in der Gelenkpfanne, wo Chondrozyten befinden. Allerdings hat die Viskosität der Gelenkflüssigkeit eine große Herausforderung für die dreidimensionale langfristige Kultivierung von Chondrozyten wurde. Zur Überwindung de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Robin Nye (Tufts Medical Center), Tomoya Uchimura und Dana Cairns (Tufts University) für die Bereitstellung von Hilfe bei der Gelenkflüssigkeit Lagerung und Zentrifugation danken. Diese Arbeit wurde von den NIH (1R01AR059106-01A1) für LZ finanziert
Materials
Table of specific reagents and equipment:
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Alginate (Alginic Acid sodium salt) | Sigma | A2158-250G | 2.4% solution stored at 40°C |
| Calcium Chloride Dihydrate, Granular | J.T. Baker | A19339 | |
| Chondrogenic Growth media | Lonza | CC-3156 (base media) | |
| CC-4409 (supplement) | |||
| Chondrogenic Differentiation Media | Lonza | CC-3226 (base media) | |
| CC-4408 (supplement) | |||
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 | |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RNeasy mini kit (for RNA extraction) | Qiagen | 74104 | |
| PCR reagents: SYBR-green | Quanta | 95053-500 | |
| 12 ml syringe | Tyco-Kendall-Monoject | 512852 | |
| 22-Gague Hypodermic Needle | Tyco-Kendall-Monoject | 8881 | |
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| Platform rocker | Thermoscientific thermolyne | Vari-mix | |
| Primers sequences | |||
| Collagen IIa-forward | 5′-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3′ | ||
| Collagen IIa-reverse | 5′-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3′ | ||
| MMP13-forward | 5′-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3′ | ||
| MMP13-reverse | 5′-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3′ | ||
| Caspase 3-forward | 5′-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3′ | ||
| Caspase 3-reverse | 5′-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3′ |
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