מערכת 3D עבור chondrocytes culturing האדם במפרק של נוזל סינוביאלי
Summary
מערכת 3D של האדם culturing chondrocytes במפרק ברמות גבוהות של נוזל סינוביאלי מתואר. הנוזל הסינוביאלי משקף את microenvironment הטבעי ביותר עבור הסחוס במפרק, וניתן להשיג בקלות ומאוחסנים. מערכת זו ולכן יכול לשמש ללימוד התחדשות הסחוס ועל הרפוי ההקרנה לטיפול בדלקת מפרקים.
Abstract
הרס הסחוס היא תכונה מרכזית פתולוגי של דלקת מפרקים ניוונית, הסיבה המובילה למוגבלות בארה"ב. הסחוס הבוגר אינו מחדש ביעילות רבה in vivo, וכתוצאה מכך, דלקת מפרקים ניוונית גורמת לאובדן בלתי הפיך סחוס מלווה כאבים כרוניים 1,2 תנועה. הנדסת רקמות סחוס מציעה פוטנציאל מבטיח להתחדש ולשחזר תפקוד הרקמה. טכנולוגיה זו כרוכה בדרך כלל chondrocytes זריעת לתוך פיגומים טבעי או סינתטי culturing 3D וכתוצאה מכך לבנות בינוני מאוזן על פני תקופה של זמן עם מטרה של הנדסת רקמות ביוכימית ובוגרת biomechanically כי ניתן להשתיל לתוך האתר פגם in vivo 3-6 . השגת מצב אופטימלי לצמיחה chondrocyte בתצהיר מטריצה היא חיונית להצלחה של הנדסת רקמות הסחוס.
ב סחוס חלל יליד משותף, בבית ארטיקתואר בלבד משטח עצם טובל הנוזל הסינוביאלי. זה נוזל שקוף וצמיג מספק חומרים מזינים הסחוס במפרק avascular והוא מכיל גורמי גדילה, ציטוקינים ואנזימים חשובים לחילוף חומרים chondrocyte 7,8. יתר על כן, נוזל סינוביאלי מאפשר חיכוך נמוך התנועה בין משטחי הסחוס בעיקר באמצעות הפרשת שני מרכיבים מרכזיים, ואת hyaluronan lubricin 9 10. לעומת זאת, הסחוס ורקמות מהונדסים תרבותי לרוב בתקשורת מלאכותית. בעוד כלי התקשורת הללו עשויים לספק תנאים מוגדרים יותר לחקר מטבוליזם chondrocyte, נוזל סינוביאלי ביותר ומשקפת את הסביבה הטבעית של chondrocytes במפרק אשר מתגוררים בה
ואכן, נוזל סינוביאלי יש את היתרון של להיות קל להשיג חנות, לעתים קרובות ניתן מתחדש באופן קבוע על ידי הגוף. כמה קבוצות יש להשלים את המדיום תרבות עם נוזל סינוביאלי בגידול האדם ארנב, שור והכלב גhondrocytes, אך משמש בעיקר רק רמות נמוכות של נוזל סינוביאלי (מתחת ל 20%) 11-25. בעוד chondrocytes, עוף סוס האדם כבר בתרבית בינוני עם אחוז גבוה יותר של נוזל סינוביאלי, מערכות אלה התרבות היו דו מימדי 26-28. כאן אנו מציגים את השיטה שלנו של כונדרוציטים culturing האדם במפרק במערכת 3D עם אחוז גבוה של נוזל סינוביאלי (עד 100%) על פני תקופה של 21 ימים. בעשותו כן, התגברנו משוכה העיקריים שהוצגו על ידי צמיגות גבוהה של נוזל סינוביאלי. מערכת זו מספקת את האפשרות ללמוד chondrocytes האדם הנוזל הסינוביאלי בסביבה 3D, אשר יכול להיות משולב עם עוד שני גורמים חשובים אחרים (מתח חמצן טעינה מכני) 29,30 המהווים את הסביבה הטבעית של הסחוס לחקות את הסביבה הטבעית סחוס הצמיחה. יתר על כן, מערכת זו יכולה לשמש גם עבור assaying פעילות הנוזל הסינוביאלי על chondrocytes ולספק פלטפורמה לפיתוחסחוס התחדשות טכנולוגיות אפשרויות טיפוליות עבור דלקת פרקים.
Protocol
Discussion
בדו"ח זה, פיתחנו שיטה המאפשרת התרבות של כונדרוציטים במפרק האדם בסביבה 3D במדיום המכיל ריכוז גבוה של נוזל סינוביאלי האדם. הנוזל הסינוביאלי הוא אחד הרכיבים העיקריים המהווים את הסביבה הטבעית בחלל משותף, שבו מתגוררים chondrocytes במפרק. עם זאת, את הצמיגות של הנוזל הסינוביאלי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות רובין ניי (Tufts Medical Center), Tomoya Uchimura ודנה Cairns (Tufts University) למתן עזרה עם אחסון נוזל סינוביאלי ו צנטריפוגה. עבודה זו מומנה על ידי NIH (1R01AR059106-01A1) עבור LZ
Materials
Table of specific reagents and equipment:
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Alginate (Alginic Acid sodium salt) | Sigma | A2158-250G | 2.4% solution stored at 40°C |
| Calcium Chloride Dihydrate, Granular | J.T. Baker | A19339 | |
| Chondrogenic Growth media | Lonza | CC-3156 (base media) | |
| CC-4409 (supplement) | |||
| Chondrogenic Differentiation Media | Lonza | CC-3226 (base media) | |
| CC-4408 (supplement) | |||
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 | |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RNeasy mini kit (for RNA extraction) | Qiagen | 74104 | |
| PCR reagents: SYBR-green | Quanta | 95053-500 | |
| 12 ml syringe | Tyco-Kendall-Monoject | 512852 | |
| 22-Gague Hypodermic Needle | Tyco-Kendall-Monoject | 8881 | |
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| Platform rocker | Thermoscientific thermolyne | Vari-mix | |
| Primers sequences | |||
| Collagen IIa-forward | 5′-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3′ | ||
| Collagen IIa-reverse | 5′-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3′ | ||
| MMP13-forward | 5′-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3′ | ||
| MMP13-reverse | 5′-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3′ | ||
| Caspase 3-forward | 5′-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3′ | ||
| Caspase 3-reverse | 5′-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3′ |
References
- Centers for Disease Control and P. Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations–United States, 2005-2030. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).
- Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E. Prevalence and correlates of arthritis-attributable work limitation in the US population among persons ages 18-64: 2002 National Health Interview Survey Data. Arthritis Rheum. 57, 355-363 (2007).
- Chung, C., Burdick, J. A. Engineering cartilage tissue. Adv. Drug. Deliv. Rev. 60, 243-262 (2008).
- Glowacki, J. In vitro engineering of cartilage. J. Rehabil. Res. Dev. 37, 171-177 (2000).
- Chokalingam, K., Hunter, S. A., Gooch, C. 3D-In vitro Effects of Compression and Time in Culture on Aggregate Modulus and on Gene Expression and Protein content of Collagen Type II in Murine Chondrocytes. Tissue Eng. Part A. , (2009).
- Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
- Goldring, M. B., Goldring, S. R. Osteoarthritis. J. Cell. Physiol. 213, 626-634 (2007).
- Zvaifler, N. J., Firestein, G. S. Cytokines in chronic inflammatory synovitis. Scand. J. Rheumatol. Suppl. 76, 203-210 (1988).
- Rhee, D. K., Marcelino, J., Baker, M. The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth. J. Clin. Invest. 115, 622-631 (2005).
- Campo, G. M., Avenoso, A., Nastasi, G. Hyaluronan reduces inflammation in experimental arthritis by modulating TLR-2 and TLR-4 cartilage expression. Biochim. Biophys. Acta. , (2011).
- van de Lest, C. H., van den Hoogen, B. M., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Biorheology. 37, 45-55 (2000).
- Saxne, T., Heinegard, D., Wollheim, F. A. Human arthritic synovial fluid influences proteoglycan biosynthesis and degradation in organ culture of bovine nasal cartilage. Coll. Relat. Res. 8, 233-247 (1988).
- Lee, D. A., Salih, V., Stockton, E. F., Stanton, J. S., Bentley, G. Effect of normal synovial fluid on the metabolism of articular chondrocytes in vitro. Clin. Orthop. Relat. Res. , 228-238 (1997).
- Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte nonresponsiveness to insulin-like growth factor 1 in experimental arthritis. Arthritis Rheum. 32, 894-900 (1989).
- Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van Wyk, J. J., van de Putte, L. B. Insulin-like growth factor stimulation of chondrocyte proteoglycan synthesis by human synovial fluid. Arthritis Rheum. 32, 66-71 (1989).
- Joosten, L. A., Schalkwijk, J., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte unresponsiveness to insulin-like growth factor-1. A novel pathogenetic mechanisms for cartilage destruction in experimental arthritis. Agents Actions. 26, 193-195 (1989).
- Schuerwegh, A. J., Dombrecht, E. J., Stevens, W. J. Synovial fluid and peripheral blood immune complexes of patients with rheumatoid arthritis induce apoptosis in cytokine-activated chondrocytes. Rheumatol. Int. 27, 901-909 (2007).
- Hegewald, A. A., Ringe, J., Bartel, J. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue Cell. 36, 431-438 (2004).
- Xu, Q. R., Dong, Y. H., Chen, S. L., Bao, C. D., Du, H. Degeneration of normal articular cartilage induced by late phase osteoarthritic synovial fluid in beagle dogs. Tissue Cell. 41, 13-22 (2009).
- Kruger, J. P., Endres, M., Neumann, K., Haupl, T., Erggelet, C., Kaps, C. Chondrogenic differentiation of human subchondral progenitor cells is impaired by rheumatoid arthritis synovial fluid. J. Orthop. Res. 28, 819-827 (2010).
- Steinhagen, J., Bruns, J., Niggemeyer, O. Perfusion culture system: Synovial fibroblasts modulate articular chondrocyte matrix synthesis in vitro. Tissue Cell. 42, 151-157 (2010).
- Yang, K. G., Saris, D. B., Verbout, A. J., Creemers, L. B., Dhert, W. J. The effect of synovial fluid from injured knee joints on in vitro chondrogenesis. Tissue Eng. 12, 2957-2964 (2006).
- Skoog, V., Widenfalk, B., Ohlsen, L., Wasteson, A. The effect of growth factors and synovial fluid on chondrogenesis in perichondrium. Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand. Surg.. 24, 89-95 (1990).
- Nuver-Zwart, I., Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Effects of synovial fluid and synovial fluid cells on chondrocyte metabolism in short term tissue culture. J. Rheumatol. 15, 210-216 (1988).
- Beekhuizen, M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Koevoet, W. Osteoarthritic synovial tissue inhibits proteoglycan production in human osteoarthritic cartilage; Establishment and characterisation of a long-term coculture. Arthritis Rheum. , (2011).
- Rodrigo, J. J., Steadman, J. R., Syftestad, G., Benton, H., Silliman, J. Effects of human knee synovial fluid on chondrogenesis in vitro. Am. J. Knee. Surg. 8, 124-129 (1995).
- van den Hoogen, B. M., van de Lest, C. H., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Br. J. Rheumatol. 37, 671-676 (1998).
- Webb, G. R., Westacott, C. I., Elson, C. J. Osteoarthritic synovial fluid and synovium supernatants up-regulate tumor necrosis factor receptors on human articular chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage. 6, 167-176 (1998).
- Kook, S. H., Son, Y. O., Lee, K. Y. Hypoxia affects positively the proliferation of bovine satellite cells and their myogenic differentiation through up-regulation of MyoD. Cell. Biol. Int. 32, 871-878 (2008).
- Knobloch, T. J., Madhavan, S., Nam, J., Agarwal, S., Agarwal, S. Regulation of chondrocytic gene expression by biomechanical signals. Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 18, 139-150 (2008).
- Guo, J. F., Jourdian, G. W., MacCallum, D. K. Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads. Connect. Tissue. Res. 19, 277-297 (1989).
- Toegel, S., Huang, W., Piana, C. Selection of reliable reference genes for qPCR studies on chondroprotective action. BMC. Mol. Biol. 8, 13-13 (2007).
- Lin, Z., Fitzgerald, J. B., Xu, J. Gene expression profiles of human chondrocytes during passaged monolayer cultivation. J. Orthop. Res. 26, 1230-1237 (2008).
- Goessler, U. R., Bieback, K., Bugert, P. Human chondrocytes differentially express matrix modulators during in vitro expansion for tissue engineering. Int. J. Mol. Med. 16, 509-515 (2005).
- Anat, J. . 121, 107-118 (1976).
