활액 유체에 Culturing 인간 관절 Chondrocytes을위한 3D 시스템

Summary

활액 액체 높은 수준의 culturing 인간의 관절 chondrocytes의 3D 시스템이 설명되어 있습니다. 활액 액체는 관절 연골의 가장 자연 microenvironment을 반영하고, 쉽게 얻은하고 저장할 수 있습니다. 이 시스템은 따라서 연골 재생을 공부 및 관절염 치료를위한 심사 치료제 사용할 수 있습니다.

Abstract

연골 파괴는 관절염의 중심 병적인 기능, 미국에서 장애의 주요 원인이다. 성인의 연골은 생체내 매우 효과적으로 재생되지 않으며, 그 결과로 관절염은 연골 손실을 돌이킬에 이르게하고 만성 통증과 부동의 ^1,2와 함께합니다. 연골 조직 공학 조직 기능을 재생 및 복원하기 위해 유망한 가능성을 제공합니다. 이 기술은 일반적으로 결과 3D 엔지니어링의 목표 생체내 ^3-6 결함 사이트에 이식 수 화학적 및 biomechanically 성숙한 조직과 일정 기간 동안 균형 매체 만드는 천연 또는 합성 공사장 공중 발판과 culturing에 시딩 chondrocytes을 포함 . chondrocyte 성장과 매트릭스 증착을위한 최적의 조건을 달성하면 연골 조직 공학의 성공을 위해 필수적입니다.

북극의 원시 공동 캐비티, 연골에뼈 ular 표면은 활액 액체에서 목욕을합니다. 이 명확하고 점성 유체의 avascular 관절 연골에 영양분을 제공하고 성장 요인, 크린 시토킨 및 chondrocyte 신진 대사를 ^7,8에 대한 중요한 효소가 포함되어 있습니다. 또한, 활액 액체는 주로 secreting 두 가지 핵심 구성 요소, hyaluronan과 lubricin ^{9 10를} 통해 연골 표면 사이의 낮은 마찰 운동을 용이하게합니다. 반면, 조직 공학 연골은 가장 자주 인공 미디어 양식입니다. 이러한 미디어 가능성이 chondrocyte 신진 대사를 공부에 대한 더 정의된 조건을 제공할 수 있지만, 활액 액체는 대부분 정확하게 관절 chondrocytes 안으로 거주하는 자연 환경을 반영

사실, 활액 액체가 얻고 저장하기 위해 쉽게되는 장점을 가지고 있으며, 자주 정기적으로 기관 보충함 수 있습니다. 몇몇 그룹은 성장 인간, 소, 토끼 및 개 C에서 활액 액체와 문화 매체를 보충해야hondrocytes하지만, 대부분의 활액 액체 (아래 20 %) ^11-25 만 낮은 수준을 사용합니다. 닭, 말과 인간 chondrocytes는 활액 액체의 높은 비율과 매체 교양되었습니다 있지만, 이러한 문화 시스템은 2 차원 ^{26-28되었습니다.} 여기는 21 일 기간 동안 활액 액체의 높은 비율 (최대 100 %)과 3D 시스템에 culturing 인간의 관절 chondrocytes 우리의 방법을 제시한다. 이렇게, 우리는 활액 액체의 높은 점도로 표시 주요 장애물을 극복. 이 시스템은 더 이상을위한 자연 환경을 모방하는 연골에 대한 자연 환경을 구성하는 두 개의 다른 중요한 요소 (산소 긴장과 기계적 부하) ^29,30와 함께 할 수있는 3D 설정에서 활액 액체 인간의 chondrocytes 공부의 가능성을 제공합니다 연골 성장. 또한,이 시스템은 또한 활액 chondrocytes에서 유체의 활동을 시금 사용 및 개발을위한 플랫폼을 제공 수 있습니다연골 재생 기술과 관절염에 대한 치료 옵션을 제공합니다.

Protocol

활액 액체에 culturing 인간의 관절 chondrocytes을위한 3D 시스템

이 작품에서 우리는 수정된 제조 - 제안 캡슐화 프로토콜 (Lonza, ^31)를 사용 알지네이트요 비즈 인간의 관절 chondrocytes를 캡슐. 이러한 3 차원 구조를 사용하여, 우리는 인간 활액 액체의 다양한 비율을 포함하는 문화 매체 culturing 전지 시스템을 개발 및 연골의 유전자 발현에 대해 이러한 3D 구조를 평가했습니다.

1. 입체 (3D) 캡슐에 대한 인간의 관절 chondrocytes (HAC)를 준비

1. 37 일 분 ° C의 물을 욕조에 인간의 관절 chondrocytes (HAC) (Lonza) (항로 2) 유리병 (1 ML)을 녹여.
2. chondrocyte 성장 미디어 (Lonza)와 세포를 수집하는 3-5 분 3,000 rpm으로 원심 분리기의 1ml와 함께 섞는다. 뜨는 폐기하십시오.
3. chondrocyte 성장 미디어 Resuspend 세포 펠렛 (Lonza).
4. 10cm 조직의 플레이트 세포문화 플레이트 (BD Biosciences) 및 chondrocyte 성장 미디어 (Lonza)의 ....

Discussion

이 보고서에서는, 우리는 인간 활액 액체의 높은 농도를 포함 매체 3D 환경에서 인간의 관절 chondrocytes의 문화에 대해 수있는 방법을 개발했습니다. 활액 액체는 관절 chondrocytes이있는 공동 구멍에 자연 환경을 구성하는 주요 구성 요소 중 하나입니다. 그러나, 활액 유체의 점도는 chondrocytes의 세 차원 장기 culturing에 대한 큰 도전을했습니다. 3D 막아야 환경에서 구축하고 방지하기 위해 집계에서도 영양소 분포를 유지하는 도전을 극복하기 위해, 우리는 부드러운 락을 함께 지속적인 운동에 따라 연골 구조를 배치. 연골 구조의 구조적 무결성을 향상시키기 위해, 우리는 비드 형성과 미디어의 변화 과정 ³¹ 시간의 길이 최적화를 포함 알지네이트요의 히드로겔에 시딩 chondrocytes의 전통적인 절차를 수정했습니다. 때 이러한 절차는 필수입니다연골 구조는 장기적인 문화 동안 점성 유체 활액로 결제됩니다.

우리는이 방법을 우리.......

Materials

시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
알긴산 (Alginic 산성 나트륨 소금)	시그마	A2158 - 250G	2.4 % 용액은 40 ° C에 보관
염화칼슘 이수화물, 세분화된	JT 베이커	A19339
Chondrogenic 성장 미디어	Lonza	CC - 3156 (기본 미디어)
		CC - 4409 (보충)
Chondrogenic 차별화 미디어	Lonza	CC - 3226 (기본 미디어)
		CC - 4408 (보충)
인간 관절 chondrocytes	Lonza	CC - 2550
Dapi (4 ', 6 Diamidino - 2 - phenylindole의 dihydrochloride)	시그마 - 올드 리치	D9542
RNeasy 미니 키트 (RNA 추출을위한)	Qiagen	74,104
PCR 시약 : SYBR 녹색	콴타	95053-500
12 ML의 주사기	Tyco - 켄달 - Monoject	512,852
22 - Gague의 피하 니들	Tyco - 켄더나 - Monoject	8881
현미경	올림포스 산	IX71
플랫폼 로커	Thermoscientific thermolyne	Vari - 믹스
Primers 시퀀스
콜라겐 IIa - 앞으로	5' - TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT - 3 '
콜라겐 IIa - 역방향	5' - CCTCTGCCTTGACCCGAA - 3 '
MMP13 - 앞으로	5' - TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT - 3 '
MMP13 - 역방향	5' - AGA AGC 개그 CTT TGA GTC AT & T GCC - 3 '
Caspase 3 - 앞으로	5' - TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA - 3 '
Caspase 3 역	5' - TGG ATG AAC 편대의 편대 장의 개그 CCA TCC TTT의 -3 '