Um Sistema de 3D para condrócitos Cultivar Humanos Articular no líquido sinovial
Summary
Um sistema 3D de condrócitos articular humana cultivo em altos níveis de líquido sinovial é descrita. Líquido sinovial reflete o microambiente mais natural para a cartilagem articular, e pode ser facilmente obtido e armazenado. Esse sistema, portanto, pode ser usado para estudar a regeneração da cartilagem e para terapêutica de triagem para tratamento da artrite.
Abstract
Destruição da cartilagem é uma característica central patológicas da osteoartrose, uma das principais causas de incapacidade em os EUA. Cartilagem no adulto não se regenera de forma muito eficiente in vivo, e como resultado, osteoartrite causa a perda irreversível da cartilagem e é acompanhada por dor crônica e 1,2 imobilidade. Cartilagem engenharia de tecidos oferece grande potencial para regenerar e restaurar a função do tecido. Esta tecnologia envolve tipicamente condrócitos semeadura em andaimes natural ou sintético e cultivar o 3D, resultando em um meio de construir equilibrada ao longo de um período de tempo com um gol de um tecido de engenharia bioquímica e biomecanicamente madura que pode ser transplantado para um local do defeito in vivo 3-6 . Atingir uma condição ideal para o crescimento de condrócitos e deposição de matriz é essencial para o sucesso da cartilagem engenharia de tecidos.
Cartilagem na articulação cavidade nativa, na articular superfície do osso é banhada no líquido sinovial. Este líquido claro e viscoso fornece nutrientes para a cartilagem articular avascular e contém fatores de crescimento, citocinas e enzimas que são importantes para o metabolismo dos condrócitos 7,8. Além disso, o líquido sinovial facilita o movimento de baixa fricção entre superfícies cartilaginosas principalmente através de secretar dois componentes-chave, ácido hialurônico e lubricin 9 10. Em contraste, a cartilagem da engenharia de tecidos é mais freqüentemente cultivados em meio artificial. Enquanto esses meios são susceptíveis capaz de proporcionar condições mais definido para o estudo do metabolismo dos condrócitos, líquido sinovial reflete com mais precisão o ambiente natural do qual condrócitos articular residem dentro
De fato, o líquido sinovial tem a vantagem de ser fácil de obter e armazenar, e muitas vezes podem ser reabastecidos regularmente pelo corpo. Vários grupos completaram o meio de cultura com líquido sinovial em crescimento humano, coelho, bovinos e cães chondrocytes, mas principalmente utilizados apenas os baixos níveis de líquido sinovial (abaixo de 20%) 11-25. Enquanto condrócitos cavalo, galinha e humanos foram cultivadas em meio com maior percentual de líquido sinovial, estes sistemas de cultura eram bidimensionais 26-28. Aqui apresentamos o nosso método de cultura de condrócitos articular humana em um sistema 3D, com uma alta porcentagem de líquido sinovial (até 100%) durante um período de 21 dias. Ao fazer isso, superamos um grande obstáculo apresentado pela alta viscosidade do fluido sinovial. Este sistema oferece a possibilidade de estudar os condrócitos humanos em líquido sinovial em um ambiente 3D, que pode ainda ser combinado com outros dois fatores importantes (tensão de oxigênio e carga mecânica) 29,30 que constituem o ambiente natural para a cartilagem para imitar o ambiente natural para crescimento da cartilagem. Além disso, este sistema também pode ser utilizada para a dosagem de atividade líquido sinovial em condrócitos e fornecer uma plataforma para o desenvolvimentoregeneração da cartilagem tecnologias e opções terapêuticas para a artrite.
Protocol
Discussion
Neste relatório, nós desenvolvemos um método que permite a cultura de condrócitos articular humana em um ambiente 3D em meio que contém altas concentrações de líquido sinovial humana. Líquido sinovial é um dos principais componentes que constituem o ambiente natural na cavidade articular, onde condrócitos articular reside. No entanto, a viscosidade do líquido sinovial tem sido um grande desafio para tridimensional de cultura de longo prazo dos condrócitos. Para superar o desafio de manter uma distribuição…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Robin Nye (Tufts Medical Center), Tomoya Uchimura e Dana Cairns (Tufts University) para a prestação de ajuda com o armazenamento de líquido sinovial e centrifugação. Este trabalho foi financiado pelo NIH (1R01AR059106-01A1) para LZ
Materials
Table of specific reagents and equipment:
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Alginate (Alginic Acid sodium salt) | Sigma | A2158-250G | 2.4% solution stored at 40°C |
| Calcium Chloride Dihydrate, Granular | J.T. Baker | A19339 | |
| Chondrogenic Growth media | Lonza | CC-3156 (base media) | |
| CC-4409 (supplement) | |||
| Chondrogenic Differentiation Media | Lonza | CC-3226 (base media) | |
| CC-4408 (supplement) | |||
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 | |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RNeasy mini kit (for RNA extraction) | Qiagen | 74104 | |
| PCR reagents: SYBR-green | Quanta | 95053-500 | |
| 12 ml syringe | Tyco-Kendall-Monoject | 512852 | |
| 22-Gague Hypodermic Needle | Tyco-Kendall-Monoject | 8881 | |
| Microscope | Olympus | IX71 | |
| Platform rocker | Thermoscientific thermolyne | Vari-mix | |
| Primers sequences | |||
| Collagen IIa-forward | 5′-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3′ | ||
| Collagen IIa-reverse | 5′-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3′ | ||
| MMP13-forward | 5′-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3′ | ||
| MMP13-reverse | 5′-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3′ | ||
| Caspase 3-forward | 5′-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3′ | ||
| Caspase 3-reverse | 5′-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3′ |
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