Vi presenterar en hög genomströmning flödescytometrisk analys för att bestämma fagocyterande förmåga av antigen-specifika antikroppar från kliniska prover, använder fluorescerande antigen-belagda pärlor och en monocytic cellinje som uttrycker flera Fc receptorer som tillhandahåller receptor användning och fagocytos bestämningar aktivitet på ett standardiserat och reproducerbar mode för alla antigen av intresse.
Antikropp-driven fagocytos induceras via engagemang Fc receptorer på professionella fagocyter och kan bidra till både clearance och patologi sjukdom. Medan egenskaper av den rörliga domäner av antikroppar har länge ansetts vara avgörande för in vivo-funktionen, har förmågan av antikroppar att rekrytera medfödda immunceller via deras Fc-domäner blivit alltmer uppskattad som en viktig faktor för deras effektivitet, både i fastställandet av rekombinanta monoklonal antikropp terapi, liksom under naturlig infektion eller vaccination 1-3.
Viktigare, trots sin nomenklatur som en konstant domän har antikroppen Fc-domänen inte konstant funktion, och är starkt moduleras av IgG-subklass (IgG1-4) och glykosylering på asparagin 297 4-6. Således, för att denna metod studera funktionella skillnader av antigen-specifika antikroppar i kliniska prover kommer att underlätta korrelation av fagocytiska pottenential av antikroppar mot sjukdomen staten, infektionskänslighet, progression, eller kliniska resultat.
Dessutom är detta effektor funktion särskilt viktigt mot bakgrund av de dokumenterade förmåga antikroppar för att öka infektion genom att ge patogener tillgång i värdceller via Fc-receptorn driven fagocytos 7. Dessutom finns det vissa belägg för att fagocytos upptag av immunkomplex kan påverka Th1/Th2 polariseringen av immunsvaret 8.
Här beskriver vi ett test för att upptäcka skillnader i antikroppsinducerad fagocytos, vilket kan orsakas av differentiell IgG-subklass, glycan struktur på Asn297, liksom förmågan att bilda immunkomplex av antigen-specifika antikroppar i en hög genomströmning mode . För detta ändamål är 1 mikrometer fluorescerande pärlor belagda med antigen, inkuberas sedan med kliniska antikropp prover, genererar fluorescerande antigen specifika immunkomplex. Dessa antibody-opsonized pärlor inkuberas därefter med en monocytic cellinje som uttrycker flera FcγRs, både hämmande och aktiverande. Assay utgång kan innehålla fagocyterande förmåga, cytokin sekretion, och mönster för FcγRs användning, och avgörs på ett standardiserat sätt, vilket gör detta ett mycket användbart system för att analysera skillnader i detta antikroppsberoende effektor funktion i både infektioner och vaccin-medierade skydd 9.
Analysen beskrivs här låter hög genomströmning analys av fagocyterande förmåga av kliniska antikroppar prov genom att använda en monocytic cellinje länge använts för att studera fagocytiska processer 10 och plattan baserade automatiserade flödescytometri. Denna analys är en fördel framför andra i sin förmåga att exakt beskriva antigen-specifik antikropp delmängder, vilket inte bara för studier av skillnader i fagocytos drivs av sjukdom antikroppar från olika ämnen, men också studier av flera antigen särdrag inom samma ämne. Eftersom antikroppar rekrytering av medfödda effektor celler, inklusive monocyter och andra antigenpresenterande celler starkt påverkar sjukdomen resultatet 11-13, och är biologiskt varierar beroende antikropp geometri, IgG subklass och glykosylering på Asparagine297 av Fc-domänen 14-16, ger denna metod för utvärdering av en kritisk antikropp verkningsmekanism. Dessutom, eftersom antikroppar-Mediated fagocytos utnyttjas av vissa patogener under infektionen 7,17,18, har denna analys löfte i utvärderingen av processen antikroppsberoende förbättring, och belyser den dubbla karaktären av fagocytos som ett potentiellt skyddande, liksom eventuellt kan skada antikropp aktivitet.
Analysen beskrivs kan användas för att analysera antikroppar från kliniska prover av patientgrupper, men också av de vaccinerade, och kan anpassas för att utnyttja serum snarare än renat IgG. Dessutom kan cytokin sekretion som svar på fagocytos analyseras från supernatant och påverkan av specifika FCR kan bestämmas med hjälp av FCR-blockerande antikroppar, vilket gör att inte bara skillnader i fagocytiska styrka som skall fastställas, men nedströms signalering händelser, med insikt in i mekanismen, och kan hjälpa till att lösa och förbättra förståelsen för detta immun mekanism.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna finansiering från NIH 3R01AI080289-02S1 och en Harvard University Center for AIDS Research Scholar Fellowship i NIH / NIAID 2P30AI060354-07.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit | Thermo Scientfic | 21935 |
|
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-50 membrane | Millipore | UFC905024 | Filter unit size may vary according to antigen size |
FluoSpheres NeutrAvidin labeled microspheres, 1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8776 | Manufacturers produce this product in various colors |
Melon Gel IgG Purification Kit | Thermo | 45212 | Care should be taken to verify the purity of Ab samples by SDS-page. |