Live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale Matrix
Summary
Cellulaire processen zoals celmigratie van oudsher bestudeerd op twee-dimensionale, stijve kunststof oppervlakken. Dit rapport beschrijft een techniek voor het direct visualiseren eiwit lokalisatie en het analyseren van eiwitten dynamiek in cellen migreren in een meer fysiologisch relevante, drie-dimensionale matrix.
Abstract
Traditioneel is celmigratie onderzocht op twee-dimensionale, stijve kunststof oppervlakken. Echter, tijdens belangrijke biologische processen zoals wondgenezing, weefselregeneratie en kanker metastase, moeten cellen navigeren door complexe, driedimensionale extracellulaire weefsel. Om beter te begrijpen van de mechanismen achter deze biologische processen, is het belangrijk te onderzoeken of het rollen van de eiwitten die verantwoordelijk zijn voor het rijden celmigratie. Hier schetsen we een protocol om de mechanismen van celmigratie het gebruik van de epitheel cellijn (MDCK) te bestuderen, en een drie-dimensionale, vezelig, self-polymeriseren matrix als een modelsysteem. Dit optisch heldere extracellulaire matrix is lastig om live-cell imaging studies en een betere bootst de fysiologische, weke delen omgeving. Dit rapport toont een techniek voor het direct visualiseren eiwit lokalisatie en dynamiek, en de vervorming van de omringende drie-dimensionale matrix.
Tentamenzoek van eiwit lokalisatie en dynamiek tijdens de cellulaire processen biedt belangrijke inzicht in de eiwit-functies. Genetisch gecodeerd fluorescerende labels bieden een unieke methode voor de waarneming eiwit lokalisatie en dynamiek. Met deze techniek kunnen we de subcellulaire accumulatie van de belangrijkste te analyseren, kracht-genererende cytoskelet componenten in real-time als de cel manoeuvres door de matrix. Daarnaast is het gebruik van meerdere fluorescerende labels met verschillende golflengten, kunnen we de lokalisatie van meerdere eiwitten tegelijk, waardoor we, test bijvoorbeeld of verschillende eiwitten gelijkaardige of uiteenlopende rollen. Bovendien kan de dynamiek van fluorescent gelabelde eiwitten worden gekwantificeerd aan de hand Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analyse. Deze meting assays het eiwit mobiliteit en hoe stabiel de eiwitten gebonden zijn aan het cytoskelet-netwerk.
Door de combinatie van live-cell imaging met de behandeling van eiwit functie-remmers,kunnen we nagaan in real-time de veranderingen in de verdeling van eiwitten en de morfologie van migrerende cellen. Verder hebben we ook combineren live-cell imaging met het gebruik van fluorescerende tracer deeltjes ingebed in de matrix van de matrix vervorming te visualiseren tijdens de celmigratie. Zo kunnen we visualiseren hoe een migrerende cel kracht-genererende eiwitten verdeelt, en waar de trekkrachten worden uitgeoefend met de omringende matrix. Door middel van deze technieken, kunnen we waardevol inzicht te krijgen in de rol van specifieke eiwitten en hun bijdragen aan de mechanismen van de cel migratie.
Protocol
Discussion
Hier beschrijven we een methode voor het gebruik van live-cell imaging om de mechanismen van de cel migratie onderzoek in een drie-dimensionale matrix. Het succes van deze techniek is afhankelijk van het verkrijgen van "goede" klonen stabiel uiten van GFP-gelabelde eiwitten. Het lage niveau van GFP eiwitten vergt een teveel excitatie blootstelling die cel gezondheid van compromissen, terwijl een te hoge GFP niveau hebben ongewenste neveneffecten op de cel. Zo is de vector keuze om genen in cellen te transfecte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken dr. Grant Sumida voor de kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een Beckman Young Investigator Award (SY), een Hellman Family New Faculty Award (SY), een NIH EUREKA, de University of California Cancer Research Coordinating Committee.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagen, bovine, Type I | BD Biosciences | 354231 | Stock is about 3 mg/ml |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | Sigma Aldrich | 281778 | Dilute in water |
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | 340855 | Dilute in PBS |
| 1M Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| Fluospheres polystyrene microspheres 1 µm, red fluorescence (580/605) | Invitrogen | F13083 | |
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | |
| Culture media components: | |||
| DMEM | Invitrogen | 31600-034 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S115500 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160-054 | |
References
- Shih, W., Yamada, S., Myosin, . A dependent retrograde flow drives 3D cell migration. Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).
- O’Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures. Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).
- Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).
- Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
- Phair, R. D., Misteli, T. Kinetic modeling approaches to in vivo imaging. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. Fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
