Een snelle<em> In vivo</em> Test om te testen op neuromodulatory verbindingen met behulp van de Giant Fiber System (GFS) van<em> Drosophila melanogaster</em> Beschreven. Nanoinjections in de kop van het dier, samen met elektrofysiologische opnames van de SBO kan onthullen bioactiviteit van verbindingen op neuronen en spieren.
Screening verbindingen in vivo activiteit kan worden gebruikt als eerste stap kandidaten die kunnen worden ontwikkeld tot farmacologische agentia 1,2 identificeren. We ontwikkelden een nieuwe nanoinjection / elektrofysiologische test die de detectie van bioactieve modulerende effecten van stoffen op de functie van een neuronale circuit dat bemiddelt de ontsnapping respons bij Drosophila melanogaster 3,4 mogelijk maakt. De in vivo assay gebruikt Drosophila Giant vezelsysteem (GFS, figuur 1) kan screening van verschillende verbindingen, zoals kleine moleculen of peptiden en vereist slechts minimale hoeveelheden te wekken effect. Daarnaast is de Drosophila GFS biedt een grote verscheidenheid van mogelijke moleculaire doelwitten op neuronen en spieren. De Giant Fibers (GFS) synaps elektrisch (gap junctions) als chemisch (cholinerge) op een Perifere Synapsing Interneuron (PSI) en de Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn) 5 </sup>. De PSI naar DLMn (Dorsale Longitudinale Muscle neuron) aansluiting is afhankelijk van Dα7 nicotine acetylcholine receptoren (nAChRs) 6. Ten slotte is de neuromusculaire knooppunten (NMJ) van de TTMn en de DLMn met de sprong (TTM) en vliegspieren (DLM) zijn glutamaat 7-12. Hier hebben we laten zien hoe je nanoliter hoeveelheden van een stof te injecteren, terwijl het verkrijgen van elektrofysiologische intracellulaire opnames van de Giant Fiber System 13 en hoe de effecten van de verbinding op de functie van dit circuit te controleren. We tonen specificiteit van de test met methyllycaconitine citraat (MLA), een nAChR antagonist, die de PSI om de verbinding DLMn maar niet de GF om verbinding of de functie van de NMJ op de sprong of vlucht spieren TTMn verstoort.
Alvorens te beginnen met deze video is het belangrijk dat je zorgvuldig in de gaten en vertrouwd raken met de Jove video met de titel "elektrofysiologische registraties van de Giant Fiber Pathway van D. Melanogaster "van Augustin et al. 7 de video hier gepresenteerde is bedoeld als een uitbreiding van deze bestaande techniek. Hier elektrofysiologische opnames methode en focus gebruiken in bijzonderheden over de toevoeging van de gepaarde nanoinjections en meettechniek.
De nanoinjection / elektrofysiologie bioassay hier gepresenteerde zorgt voor een snelle screening van verbindingen in het zenuwstelsel van de fruitvlieg. Dit is een nieuwe in vivo techniek dat kleine hoeveelheden van een verbinding vereist invloed op een verscheidenheid van eiwitten wekken in een goed gekarakteriseerd neuronale circuit. Deze methode kan worden gebruikt om de biologische activiteit van verschillende verbindingen testen van onbekende toxinen in de handel verkrijgbare farmacologische agentia.
…The authors have nothing to disclose.
Wij willen de leden van de Mari-lab en de Godenschwege lab, te erkennen in het bijzonder Aline Yonezawa, voor commentaar en hulp bij dit protocol. Dit werk werd gefinancierd door het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke subsidie R21NS06637 naar FM-en TAG; AB werd gefinancierd door de National Science Foundation Award nummer 082925, URM: Integratieve Biologie voor toekomstige onderzoekers.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Recording glass electrodes: borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 1.0mm OD, 0.58mm ID |
Stimulator | Grass Instruments | Model S48 | |
Amplifier | Getting Instruments Inc. | Model 5A | |
Data acquisition Software: Digidata | Molecular Devices | Model 1440A | |
Data collection software: pCLAMP | Molecular Devices | Version 10 | |
Stereomicroscope with fiber optic microscope ring illuminator | AmScope | SM-4T Model HL250-AR |
|
Dissecting scope for mounting | AmScope | SM-2TZ | |
Kite Manual Micromanipulator & Tilting Base | World Precision Instruments | Model # M3301 Kite: Model # KITE-M3-L |
|
Drosophila melanogaster Wild 10E genotype (wild type strain) | Bloomington Stock center | Stock # 3892 | |
Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | Model 700c | |
Injection glass micropipettes: Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | Catalogue # 4878 | 1.14mm OD, 0.5mm ID |
Silicon oil | Fisher | Catalogue # S159-500 | |
Beveler | Sutter Instrument Co. | K.T. Brown Type Model # BV-10 |
|
Nanoliter2000 | World Precision Instruments | Catalogue # B203XVY | |
Blue food coloring | McCormick | N/A | Ingredients: Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1, and 0.1% Propylparaben (preservative). |
Methyllycaconitine citrate (MLA) | Tocris Bioscience | Catalogue # 1029 | |
Plastic wax sticks | Hygenic Corporation (Akron Ohio USA) |